北京冬奥会运动员们都完美诠释了奥运精神。在生物工艺开发中，纯化层析介质POROS 也有着更高（载量），更快（流速），更强（覆盖）的奥运精神哦。

亲和介质实现特定的捕获

在抗体类生物药的下游工艺中，亲和层析是一个流行的first-line纯化步骤。利用配体和目标分子之间的相互作用。理想的配体-靶标相互作用是特异性强的，因此只有靶标分子结合而非靶标分子不结合。亲和层析法是有效的。有时一步就能达到高纯度。在某些情况下，亲和树脂已经很好地建立了特定的biotherapeutic。例如，单克隆抗体的纯化依赖于一种蛋白A的特异性亲和配基。然而，许多生物治疗分子缺乏成熟的亲和纯化工艺或市场上可获得的亲和介质。

图1:CaptureSelect亲和配体来自于骆驼免疫球蛋白(Ig)抗体，该抗体已被削减到n端结构域(VHH片段)，包括可变抗原结合区域，也称为互补决定区域(CDR)，(绿色、蓝色和红色显示)。亲和配体的抗原结合区域可以被调整以特异性地识别和捕获目标分子，包括已知的蛋白质标签和未标记的蛋白质。

可调节的亲和配体，例如Thermo Fisher Scientific的CaptureSelectTM亲和层析技术中使用的配体，可以扩展生物疗法的纯化选择。这些配基来自于在骆驼体内发现的一种仅重链抗体的可变抗原结合区。典型的抗体由两条重链和两条轻链组成，形成二聚体;骆驼羚抗体缺乏这种轻链，但保留了特异性和强效结合抗原的能力。研究人员对骆驼抗体进行了生物工程改造，使其只包含可变的抗原结合区域，称为VHH片段(图1)。VHH片段的可变抗原结合区域可以被修改，以“调整”配体，使其几乎可以针对任何抗体、蛋白质或病毒载体。

用于纯化抗体的 CaptureSelectTM亲和层析选择

基因治疗领域用于纯化AAV病毒载体的亲和层析介质

用于纯化mRNA分子的亲和层析介质 ：POROS™ Oligo (dT)25

但在某些情况下，亲和力捕获可能不是目标分子的选择。即使是可以通过亲和步骤捕获的分子，通常也需要额外的纯化步骤，以确保所有非目标分子被去除。这些后续的层析精纯步骤大多基于非亲和层析介质，如离子交换或疏水相互作用色谱。
 

介质硬度和孔隙率的考虑

介质beads的大小、孔隙度和结构因素各不相同，这些因素会影响纯化过程的速度和效率。来自Thermo Fisher Scientific的POROS™层析介质具有几个物理特性，使其能够有效地分离混合物中的分子。

图2:扫描电子显微镜图像显示左侧的POROS beads，右侧的放大图像显示大的通孔。这些beads具有增加的表面积，因此在保持将目标分子从杂质中分离出来的能力同时，具有更大的结合能力。

POROS beads的尺寸较小为50 μm，但孔径较大。小尺寸和beads内孔隙率有效地增加了目标分子和介质之间的相互作用表面积，并能够更好的分离(图2)，POROS介质降低了传质阻力，意味着分子更容易进出beads。工艺开发人员用较少的缓冲溶液体系来纯化目标物，从而增加载量以及高度浓缩纯化后的目标物。
 

影响介质选择的另一个因素是:介质的清洗和洗脱步骤中的条件，如pH值、盐的类型和浓度。它们将影响生物疗法结合或从介质中洗脱的效果，以及非目标分子被洗掉的效果。介质应能在各种条件下保持其物理化学性质。它们在使用后还需要清洗，以防止样品的交叉污染和控制细菌生长的风险;这一过程通常涉及到刺激性的化学物质。POROS 基架是由使介质在各种条件下更稳定的材料制成的。
 

硬质介质的另一个好处是，产业化放大更容易操作。可以在不显著影响结合能力的情况下增加流速，这意味着可以在更高流速下进行纯化，减少处理时间，从而提高生产率。一般来说，硬质介质能够承受高反压和高流速，高反压会导致纯化失效并堵塞设备，通常情况你不想要容易破裂的介质。而有能力处理机械应力和高流速，后者对于工业规模的过程尤其重要，因为这涉及到更大的色谱柱和样品体积。
 

除了它们的物理性质，介质可以被修饰用于离子交换或疏水相互作用层析，这两种方法都可以帮助纯化生物药物。

离子交换层析介质

离子交换色谱法根据目标分子和介质之间的电荷相互作用来分离。有两种基本类型: 阴离子交换，用带正电的介质与带负电的目标分子结合; 阳离子交换，用带负电的介质与带正电的目标分子结合。非目标分子也可以根据其电荷被捕获，并允许目标分子通过介质不受阻碍地收集。通过提供不同的电荷选择性，离子交换介质可以为目标分子纯化提供量身定制的解决方案。
 

POROS阳离子和阴离子交换介质通过最大限度地提高产品产量和去除非目标分子，帮助改善生物药的大规模纯化生产。例如，阳离子交换层析是Avastin®工业纯化的一个组成部分，（Avastin®是一种用于治疗胶质母细胞瘤、黄斑变性和其他疾病的单克隆抗体）。为了提高生产工艺的纯度和收率，Avastin的制造商探索了将POROS阳离子交换介质纳入生产流程的方法，与之前使用的介质相比，改用POROS HS 50提高了11%的收率。此外，与之前的方法相比，POROS阳离子交换介质从产品中去除了更多的污染病毒。
 

另一个案例是正在寻找一种介质，可以去除亲和层析步骤后残留的杂质。就目前的情况来看，他们的阴离子交换步骤需要低流速来实现产物分离。这意味着样品和缓冲液通过纯化柱需要更多的时间，导致纯化柱大，纯化时间长。该公司的工艺开发人员对Thermo Fisher Scientific公司的阴离子交换树脂POROS HQ进行了评估，并对其进行了优化，使其成为一直使用的填料产品选择。他们能够将柱流速提高4倍以上，并将处理时间缩短10倍。该公司还能够装载超过两倍的样品到柱上，并获得了与之前方法相比较的收益率。最后，POROS HQ帮助去除大部分杂质和病毒，如异嗜性小鼠白血病病毒，这是一种可以感染哺乳动物细胞培养系统的常见病毒。
 

疏水相互作用层析介质

疏水相互作用层析(HIC)介质的工作原理是，柱上的疏水配体可以与目标分子的疏水表面基团结合。疏水性介质在相互作用中可以从弱到强，这取决于对目标分子的选择性。HIC介质在试图从密切相关的分子中分离生物药物分子时特别有效果，包括自聚集，即目标分子粘在自己身上并形成一团分子。自聚集会降低生物药物的安全性或有效性。它们通常具有不同于单体生物药的物理化学性质，这可以利用疏水层析技术，特别是用于去除自聚集物。
 

工艺开发人员与Thermo Fisher Scientific合作，帮助其改进已建立的治疗性单克隆抗体的纯化过程，具体目标是最大限度地去除聚集物。原始工艺中HIC层析没有被包括在纯化方案中，因为高效的疏水分离需要高盐浓度的缓冲液，这会破坏目标抗体的稳定性。该工艺的开发人员使用了强疏水性层析介质POROS Benzyl Ultra，它允许在非常低的盐条件下使用。为了优化生产效率，介质被操作在流穿模式。这意味着含有目标分子的溶液流穿柱子，而具有更多总疏水表面积的聚集体被结合到柱上，从而从最终产品中除去。最后，使用强疏水性介质，精纯步骤成功，聚体去除效率高，单体接近完全回收，最终产品收率提高8%。并且纯化效率提高4倍。
 

通过在工艺开发工具箱中拥有各种介质选项，开发人员可以为正在开发的各种生物药分子定制他们的纯化工艺。随着对新型生物疗法的需求不断上升，高效和可规模化的纯化策略将是满足临床需求的关键，无论是现在还是未来。