檀香烯是倍半萜类具有代表性的化合物之一，也是檀香精油的主要成分，在医药、食品、香料等领域有着重要的应用。由于天然檀香资源十分有限，且难以获得，合成生物学方法利用微生物细胞工厂大规模生产檀香烯成为解决这一难题的新思路。Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene浙江大学连佳长课题组首次利用毕赤酵母细胞工厂高效合成倍半萜类化合物α-檀香烯。
研究通过优化启动子，促进了α-檀香烯合成酶基因（SAS） 表达、甲羟戊酸（MVA）途径关键基因的过表达，以及SAS多拷贝整合构建工程菌株。结合培养基和生物工艺优化，后的工程菌株（STE-9）能够在摇瓶、分批发酵和补料分批发酵中分别生产滴度高达829.8 ± 70.6 mg/L，4.4 ± 0.3 g/L和21.5 ± 1.6 g/L的檀香烯。  
构建产α-檀香烯毕赤酵母株
首先实验将密码子优化的α-檀香烯合成酶基因（SAS）引入毕赤酵母中使其能够生产α-檀香烯。在一系列组成型启动子和甲醇诱导型启动子中，TEF1p菌株（STE-1）的α-檀香烯产量更高。以酿酒酵母工程菌株对照进行发酵实验，证明毕赤酵母在表达外源基因和合成萜类化合物方面具有优势。
MVA途径基因过表达和SAS多拷贝整合提高产量
提高MVA途径的代谢通量是提高萜类化合物产量的有效策略。将tHMG1和IDI1-ERG20整合到STE-1的基因组中，分别获得工程菌STE-3和STE-5。同时过表达tHMG1和IDI1-ERG20（STE-6）使α-檀香烯的产量增加到246.9 ± 33.8 mg/L，约为STE-1的2.74倍。由于乙酰辅酶A是MVA途径的直接前体，乙酰辅酶A合成酶基因（ACS*）的过表达使α-檀香烯的产量进一步提高到282.4 ± 44.1 mg/L。

为了进一步提高α-檀香烯的产量，构建了含有SAS多拷贝的毕赤酵母工程菌。将SAS的额外拷贝整合到STE-1、STE-3和STE-7中，获得工程菌STE-2、STE-4和STE-8，α-檀香烯产量分别是其单拷贝菌株的1.9倍、1.55倍和1.56倍。随着SAS拷贝数的增加，发现3个拷贝SAS的菌株更为适宜。
 
培养基优化提高产量
进一步通过培养基组分优化提高产物产量。选择4种不同的蛋白胨测试对α-檀香烯生物合成的影响。摇瓶发酵YP1D组α-檀香烯产量更高，达829.8 ± 70.6 mg/L。YP1D为更适合的培养基组分。
T&J-MInibox 平行生物反应器发酵提高产量
将优化后的工程菌株STE-9用于1-L发酵罐（MInibox，迪必尔生物工程（上海）有限公司）的分批和补料分批发酵对照研究，以便选择更合适的培养策略。补料分批发酵种，种子被接种至含有600 mL YP1D培养基的发酵罐。发酵温度控制在30°C，DO 100%，罐体压力保持在0.8个大气压。24 h后，发酵罐中加入10%（v/v）正十二烷。当葡萄糖浓度减少至1 g/L时，进行恒速补料，搅拌速率维持在200-800 rpm，DO约20%。在发酵后期对pH进行调节，并定期测定OD600、葡萄糖浓度、乙醇浓度和产物浓度。
在分批发酵罐中，α-檀香烯的产量为4.4 ± 0.3 g/L，而在补料分批发酵罐中，α-檀香烯的产量高达到21.5 ± 1.6 g/L。补料分批发酵显著提高产量。该研究利用迪必尔生物反应器成功打破了目前为止报道的α-檀香烯的合成纪录，证明了合成生物学方法利用毕赤酵母细胞工厂在生产萜类化合物和其他天然珍贵产物上的优势。

参考文献：
1、Zuo Y, Xiao F, Gao J, Ye C, Jiang L, Dong C, Lian J. Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene. J Agric Food Chem. 2022 Jun 21. doi: 10.1021/acs.jafc.2c02353. Epub ahead of print. PMID: 35729733.
2、https://mp.weixin.qq.com/s/QHQERgNHVE5LHtkULgkvHA