利用质谱仪开展的蛋白组学研究中，质谱的扫描速度会影响蛋白的鉴定深度。与传统3D蛋白组学保留时间、质荷比、离子强度相比，timsTOF Pro双TIMS/PASEF分离技术，使得蛋白质组学进入4D蛋白质组学新时代。4D分离技术增加第四个维度—离子淌度（mobility），进而大幅提高扫描速度和检测灵敏度，提升蛋白鉴定的数量和覆盖率。

本期推送用2个研究案例带你了解基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学到底好在哪？一起来看看吧！

案例一

发表在Metabolites上的一项题为“Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected withSchirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations”的研究采用timsTOF Pro对泪液及结膜细胞进行蛋白质组学分析，该研究强调了结合高数据采集速度和timsTOF Pro中基于离子迁移率的分离，可以为泪液等有限样本的生物标志物研究带来新的维度[1]。

研究利用timsTOF Pro，采用全面的蛋白质组学方法，研究从整个 (W, whole) 泪液检测滤纸 (ScS, Schirmer strips) 及其两个部分--结膜囊内部分 ( B, bulb) 和滤纸的其余部分 (R, rest of the strip) 采集的样本的人类蛋白质组图谱。从两名健康受试者的四次不同就诊中收集8个ScS，分为三批，即4W、4B和4R。在W、B和R批次中总共鉴定出1582种蛋白质。在所有已鉴定的蛋白质中，结合蛋白 (43.4%) 和具有催化活性的蛋白 (42.2%) 占分子功能的80%以上。最具代表性的生物过程是细胞过程 (31.2%) 、代谢过程 (20.8%) 和生物调节 (13.1%)。酶是最具代表性的蛋白质类 (41%)，主要由水解酶 (47.5%)、氧化还原酶 (22.1%) 和转移酶 (16.7%) 组成。与结膜接触的部分 (B) 可能由于同时收集泪液和细胞蛋白质，因此有助于更多蛋白质的鉴定。

研究对来自三组（W、B和R）的所有已鉴定蛋白质进行GO富集分析发现，timsTOF Pro的强大之处在于，它可以分离具有相同质量电荷比 (m/z) 的不同分子，图1显示了如何通过对两个具有几乎相同质量的靶向肽（白细胞弹性蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白）进行测序来评估肽表征。这些蛋白质以相同的保留时间和非常相似的m/z进行共洗脱，但由于timsTOF Pro的三维离子迁移特性，这些肽被区分开来。

图1 离子迁移率的可视化热图。timsTOF-Pro分析表明，在一个时间点，两种不同蛋白质的肽离子具有几乎相同的质量电荷比 (m/z)。圆圈线表示两个前体离子的m/z和迁移率位置，这两个前体离子通过平行累积连续碎裂技术 (PASEF) 进行碎裂。

案例二

发表在J ProteomeRes上的一项题为“Ultrafast and Reproducible Proteomicsfrom Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro”的研究开发了一种由Azo（一种可光降解、与MS兼容的表面活性剂，可有效溶解蛋白质并促进快速胰蛋白酶消化）与Bruker timsTOF Pro相结合的超快全面蛋白质组学方法，该方法通过捕获离子迁移谱 (TIMS) 和肽的平行累积连续碎裂技术 (PASEF) 实现更深的蛋白质组覆盖。研究通过应用该方法分析复杂的人类心脏蛋白质组，并在一次高重复性的一维LC-TIMS-MS/MS运行中，从1 mg人类心脏组织中鉴定出近4000个蛋白质组。总的来说，预计这种由Azo和timsTOF Pro相结合的超快速、稳健和可重复的全面蛋白质方法将普遍适用，并大大加快大规模定量蛋白质组学研究的速度[2]。

文章中提到，由于心脏蛋白质组是高度复杂的，timsTOF Pro增强的敏感性使蛋白质组覆盖范围更广。timsTOF Pro在不牺牲灵敏度的情况下，通过PASEF大大提高了MS/MS测序速度。在这种模式下，从LC柱中共稀释的离子在TIMS单元中并行累积，根据其TIMS迁移率分离为离散的数据包，然后，结合快速四极切换，连续喷射并经受MS/MS（图2B）。该过程显著增加了从K562全细胞裂解物消化物中鉴定出的作为参考标准的蛋白质组和肽的数量。利用PASEF，研究能够从三次注射的200 ng K562全细胞裂解液中鉴定出6364个蛋白质组和60159个肽，相比之下，在PASEF和TIMS被禁用的同一样本中，只有2531个蛋白质组和15815个肽，这说明了PASEF能够极大地扩大蛋白质组的覆盖范围。

图2 在timsTOF Pro上使用Azo和PASEF的全面蛋白质组学工作流程。(A) 样品制备，包括 (1) 组织切割（可扩展至1mg组织），(2) 光降解表面活性剂偶氮中的组织均质，(3) 快速胰蛋白酶消化（最快30分钟），以及 (4) 在 (5) RPLC-TIMS-MS/MS之前的偶氮降解和C18脱盐。(B) timsTOF Pro上的PASEF示意图，展示了

SBC 蛋白研究技术平台

SBC拥有业内高水平的蛋白研究技术平台，timsTOF Pro液质联用仪、Simoa数字单分子免疫阵列分析仪、ELISA和Western Blot实现蛋白质组学分析和验证，涵盖蛋白质定性、定量和修饰研究。

参考文献：

[1]Akkurt Arslan M, Kolman I, Pionneau C, et al. Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected with Schirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations. Metabolites. 2021;12(1):2. Published 2021 Dec 21. doi:10.3390/metabo12010002

[2]Aballo TJ, Roberts DS, Melby JA, Buck KM, Brown KA, Ge Y. Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro. J Proteome Res. 2021;20(8):4203-4211. doi:10.1021/acs.jproteome.1c00446