上海交通大学医学院 课题组长

 

中国“脑计划”已于2021年底开始实施，成为继美国的“BRAIN Initiative”，欧洲的“Human Brain Project”和日本的“Brain/MINDS”之后，推动脑科学研究的又一重要举措。各国“脑计划”的一个核心目标是——理解大脑的神经活动如何塑造认知和产生行为。

 

     1. 神经元集群     

 

什么样的神经活动能够恰当地反映大脑功能？

经典的神经元学说(neuron doctrine)提出单个神经元是大脑的功能单位。然而，单个神经元常表现明显的活动不稳定性和功能多变性，对相同的外界刺激往往有显著的差异反应（视频1），难以成为大脑的功能单位。

由于神经元并非孤立存在，它们可直接或间接地经由物理连接(如突触)与其它神经元形成多样的功能结构；于是神经元集群(ensemble)、集合 (assembly)及印记(engram)等相近的功能概念被提出。集群概念与神经环路侧重于物理连接不同，更偏重于描述同一脑区内能够被反复地共同激活的一群神经元^{[1, 2]}。

 

集群有何特征？

构成集群的神经元在空间上可分散分布，也不必具备完全相同的功能偏好^{[3, 4]}，但它们的集体活动模式可编码大脑对外界刺激(如光带的朝向和运动)或内在状态(如对某场景的恐惧记忆)的应答。如今，集群作为大脑的基本功能单位的假说正被接受^{[1, 2]}。本文将以小鼠为模型简要阐述集群的活动及功能研究。

 

     2.神经元集群研究方法     

 

首先如何找到集群？

目前尚未发现明显的集群分子标记，说明集群的形成很可能由神经元的互作模式决定^[1]，与谱系及遗传特征关系不大。因此集群的确定需要同时记录一大群神经元各自的活动轨迹，这限制了传统的膜片钳或微电极记录方法的使用。

如何高效准确地同时记录大量神经元的活动？研究人员根据神经元电活动导致的物理化学变化(如膜电位升高、钙离子内流、基因转录及表达等)，开发了不同的手段。

其中，针对大量神经元的电压变化进行成像是最直接的方法。目前有不少电压指示剂(染料或蛋白)能够根据神经元电压变化而改变荧光信号强度，可用于检测动作电位及阈下电位^[5]。然而，电压成像虽拥有近乎完美的时间分辨率，却常受限于极低的信噪比(图2)，暂时难以在大脑功能研究中推广。

图2. 电压成像：电压敏感指示蛋白的荧光变化能够反映神经元胞体和树突快速的电压变化(A)，但信噪比低(B)

(修改自Adam, Nature, 2019)

神经元被激活会导致一系列即刻早期基因(immediate early gene，IEG)，如c-fos、Arc等快速转录及表达。通过检测IEG或者由它们的启动子所驱动的荧光蛋白的表达，可标记于同一时段内被激活的神经元(图3)。该方法适用于在全脑范围高效标记集群^[6]，但局限于较低的时间分辨率(mRNA，约数分钟; 蛋白，约数小时)，难以准确关联集群功能及行为。

图3. 即刻早期基因介导的活性标记：即刻早期基因的快速转录及翻译可用于标记被激活的神经元

(修改自Zelikowsky, J Neurosci, 2014; Tayler, Curr Biol, 2013)

钙(离子)成像是目前确定集群及研究其活动的主流技术选择。由于神经元的动作电位发放显著提高其胞体的游离钙离子浓度，使用对钙离子浓度高度敏感的荧光染料或蛋白，即可通过捕捉其荧光变化间接检测神经元的活动(图4)。

虽然钙离子浓度变化慢于电压变化，致使钙成像不如电压成像般有毫秒级别的时间分辨率，但其荧光信号足够强及稳定，因而被广泛用于脑内集群的功能研究^[7]。

以上方法各有优劣，本文将就钙成像进行阐述。

图4. 钙成像：根据对钙离子敏感的染料(A)或指示蛋白(B)的荧光变化(C)，检测大量神经元的电活动

(修改自 方伟群，Cell Rep, 2017; 及未发表数据)

钙成像如何帮助记录集群活动？

首先需要使用特异结合钙离子的荧光指示剂或蛋白探针标记大量神经元。该目标的实现可通过将具有细胞渗透性的荧光染料(如OGB1等) 注射入脑内(图4)，或通过病毒介导将钙指示蛋白(如GCaMP或jRGECO等)表达于脑内神经元(图4)，或使用编码GCaMP的转基因小鼠(如Thy1-GCaMP6f或TIGRE等；图5)。 

图5. GCaMP6f转基因小鼠：转基因小鼠稳定表达钙指示蛋白用于钙成像

(修改自Scott, Neuron, 2018)

 

     3.神经元集群的功能成像、分析和干预     

 

接下来需要解答的是如何实时捕捉神经元的荧光变化?

可通过单光子，双光子乃至三光子显微成像系统实现。由于大脑对长波长的光(如红外光)散射较少，随着单、双及三光子系统所采用的激发光波长递增，它们的成像深度也大体递增。

因此，普通的单光子系统(如共聚焦显微镜)通常适用于对很浅层的脑组织成像，或通过植入光纤对深部脑区和核团成像，但受限于较低的空间分辨率。而相对于单光子成像，双光子钙成像具有更深的穿透力，更高的光收集效率和更小的光毒性，成为目前脑内在体钙成像的主流方法。通过配合GRIN透镜的使用，双光子系统可探测深部脑区，提供高时空分辨率的钙影像（图6）。三光子系统的成像深度可超过1mm，为直接无创观测深部皮层的集群带来很大便利(图6)，但目前仍未得到广泛应用^[8]。本文将就双光子钙成像进行阐述。

图6. 大脑深部钙成像：使用GRIN透镜的双光子成像(A)及三光子显微成像(B)可对深部脑区进行高分辨率钙成像

(修改自Jennings, Nature, 2019; Hontani, Sci Adv, 2021）

双光子钙成像如何用于研究集群功能？
集群的活动反映其功能。但即便小鼠处于黑暗、安静和熟悉的环境中并保持静止，其各脑区的神经元仍有非常活跃的自发放电活动，研究者将难以确定该条件下集群的具体功能。

因此，为了准确判定集群功能，应将小鼠置于具体的情境或行为之下，并实时捕捉其大量神经元的活动轨迹。由于集群对刺激、环境和行为的反应存在动态变化，研究者还应较长时间地记录集群的钙活动，从中归纳出神经活动的模式，判定集群的功能偏好及特异性等。

以初级视皮层的layer2/3锥体细胞为例，我们发现给予小鼠特定模式的视觉刺激(如特定朝向的移动光栅)，能够激活相似的一群神经元，而这群神经元对其它朝向的移动光栅反应明显较弱。因此，这群神经元组成一个偏好该朝向视觉刺激的集群。这个集群在不同时间对不同朝向的活动强度反映了它的功能选择性，可被定量分析(图7)。

图7. 集群功能判定：集群对特定视觉特征的功能偏好及选择性可被定量分析

(方伟群，未发表数据)

在体双光子钙成像结果能够提示集群功能与认知及行为的相关性，还需再结合集群调控技术(如光遗传学等)，验证二者的因果关系。

然而，传统的光遗传学调控方式存在明显缺陷：

1) 常采取面刺激方式，在短时间内无差别地激活或抑制表达光敏蛋白的大量神经元，其强度远高于生理状态下的神经活动强度，很可能造成假象；

2) 虽然采用遗传标记等方法可仅在特定细胞类型中表达光敏蛋白，实现对细胞类型或投射的特异性干预，但对于相邻的同类型神经元仍无能为力。双光子光遗传学解决了这一难题(图8)，比如通过使用空间光调节器(spatial light modulator, SLM)将一束激光分为若干小光束，而每一小光束仅聚焦于同一集群的特定神经元上，同时激活或抑制它们。

再结合使用定位于胞体的钙离子探针和光敏蛋白，可进一步减少由于神经突起交错导致的非特异性刺激。因此，双光子光遗传学可实现对任意神经元的光刺激，精准地调控集群^[9]。

图8. 双光子同步钙成像及光遗传学：双光子光遗传学刺激(A)，结合胞体定位的钙指示蛋白(B)和光敏蛋白(C)，可实现精准钙成像和活性调控

(修改自Yang, eLife, 2018; Shemesh, Nat Neurosci, 2017; Shemesh, Neuron, 2020）

双光子技术调控的集群功能是否反映认知及行为？

以初级视皮层的研究为例，研究者可根据双光子钙成像的结果，确定编码特定视觉特征(如光栅的朝向)的集群，再以双光子光遗传学技术特异地激活该集群，对小鼠植入假的视觉信号，活化其下游的环路，使小鼠误认为接受到特定指令而启动视觉诱发的饮水行为(图9)^[10]。

在另一例子中，作者采用类似的“全光学”双光子成像和调控系统，识别及激活海马体中的位置细胞集群，改变小鼠的空间记忆(图10)^[11]。此类研究证明了精准地操纵特定集群的活动可改变小鼠的认知及行为。

图9. 集群与视觉感知：双光子光遗传学激活视觉皮层神经元集群(A)，诱发视觉感知及视觉引导行为(B) 

(修改自Marshel, Science, 2019）

 

图10. 集群与空间记忆：双光子“全光学”成像及调控系统(A)能够精准激活海马体中的位置细胞集群，改变小鼠的空间记忆(B) 

(修改自Zhang, Nat Methods, 2018; Robinson, Cell, 2020）

以上对集群的功能成像、分析和干预是依次分别开展的，并非最理想的选择。能否做到三个步骤同步进行，即所谓“闭环”操纵集群^[12]？

这要求系统能够 “在线”实现准确的活性捕捉，快速的功能判定和高效的活性调控。这样的闭环系统可以迅速反映集群与行为的即时关联，并及时反馈，调控集群而改变行为，很可能是研究集群功能与行为的最佳方案(图11)^{[12, 13]}。

在这样的方案下，研究者可选择性地激活特定一群神经元，重现或改变原有集群的活动模式，甚至设计构建新的集群，实现模拟、植入乃至矫正认知的目的，有望为正常及疾病大脑的神经机制研究提供独特视角和工具。

图11. 双光子“闭环”系统能够同步读写集群活动，操控动物行为

(修改自Hausser, N Engl J Med, 2021）

 

     4. 神经元集群与神经疾病     

 

由此引出一个新问题，集群变化是否可作为脑疾病的神经病理指标？

由于双光子系统能够准确定位集群的构成神经元的空间分布，精准追踪及改变其活动轨迹，使得集群的结构和功能具备高度可定量性。集群的功能判定是基于特定情境和行为下神经元的集体活动模式，反映了神经元之间的功能互作，提示集群变化或许可作为神经环路功能的内表型(endophenotype)。

确实，集群在脑疾病(如自闭症，精神分裂等)小鼠模型中产生明显变化^{[4, 14]}，与采用其它脑功能检测技术(如fMRI，微电极阵列等)得到的结论吻合。但是，目前对脑疾病模型中集群的研究仍处于特征描述阶段，未能有效调控集群，重现或逆转疾病症状。因此，集群变化是否可作为脑疾病的重要贡献因素，其充分性和必要性都尚未得到深入探究。

为了更好揭示集群与认知和行为的关系，有必要阐明集群的运行和演进机制。我们需要了解集群的结构及功能如何形成与发展，存在何种可塑性和关键期，有何独特的细胞互作机制，同一脑区功能相关的集群如何竞争(competition)、互补(complementation)、分离 (separation)和整合(integration)，以及不同脑区的上下游集群如何沟通信息。

通过对集群机制的研究，我们有望验证：操控集群功能是否可以重现或逆转疾病的核心表型。这些问题也是本课题组的研究兴趣所在。我们有理由相信，基于集群成像的高时空分辨率及光调控的精准性，对集群的深入研究将有助于在介观层面解析神经环路的功能与可塑性，助力对大脑运行规律的解码，使人类更懂得人类。

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