普瑞邦免疫亲和柱在维生素B12检测新国标实施发布的应用
2022-09-13 来源:本站 点击次数:2566维生素B12是一类含有咕啉(corrin)环的类咕啉(corrinoids)化合物，其通俗名称又叫做钴胺素(cobalamin)，是唯一的一类含金属元素的维生素。维生素B12的化学结构如下图所示，根据咕啉环轴向上方的R基不同，形成了不同类型的维生素B12类物质。如羟基（-OH）与咕啉环中的钴离子相连形成羟基钴胺素（hydroxycobalamin），同样，脱氧腺苷（5'-deoxyadenosyl）、甲基（-CH3）、氰基（-CN）与钴离子相连分别生成腺苷钴胺素（deoxyadenosylcobalamin）、甲基钴胺素（methylcobalamin）和氰钴胺素（cyanocobalamin）。日常生活中所称的维生素B12更多是指氰钴胺素，因其易结晶，不易被空气氧化，所以常被用作维生素B12的食品添加剂形式。
人体不能合成维生素B12，主要依靠动物性食品提供，含量丰富者有肝肾组织、肉类、蛋类和乳类制品等。此外特殊保健食品、功能性饮料等食品中也会含有相对较多的维生素B12。维生素B12在人体代谢当中起到非常重要的作用，缺乏维生素B12不仅会导致贫血，还会引起心脏病、神经紊乱、生育与出生缺陷以及癌症等。因此一种或几种能够精确检测食品中维生素B12含量的方法十分重要。目前常用的主要有比色测定法、微生物营养缺陷型测定法、酶联免疫吸附测定法、高效液相色谱法以及高效液相色谱串联质谱法等方法。需要考虑的因素有：动物性食品中维生素B12同时有多种存在形式，如何准确测定其真实含量。其次需要将结合态维生素B12从钴胺素结合蛋白中游离出来。还有维生素B12在食品中含量较低，如何有效富集等问题。近期新发布的国标《GB 5009.285-2022食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定》给我们提供了合适的解决方案。
我国现行的国标为《GB 5413.14-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》采用的是微生物法，仅适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的检测。国际现行方法也是微生物法，美国 AOAC 986.23方法即采用微生物法测定乳基婴幼儿配方粉中的维生素B12。此外AOAC 2011.10方法采用双柱切换-液相色谱-紫外检测法测定婴儿配方奶粉和成人营养品中的维生素B12。值得一提的是，在2010版国标修订征求意见稿中也曾将固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法纳入本标准，但未能出现在最新标准中。
新国标解读：
新国标2022版第一法为液相色谱法，适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素B12的测定。因其检测设备和耗材较为廉价、准确度较高而值得推广。第二法为液相色谱-质谱法，适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12测定。该方法是将分离性能优异的液相色谱法与灵敏度更高、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法相结合的现代分离分析技术，同时结合使用我司独立研发维生素B12同位素内标，能对维生素B12更加快速、准确的定量，而且能解决饮料等低含量样品的定量检测难题。第三法仍为微生物法，适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。
通过以上对比发现，新国标2022版中增加了多种复杂的样品基质，提高了方法的适用性，通过使用高特异性的免疫亲和柱以及维生素B12同位素内标解决了当前维生素B12分析检测的难题。在对应的第一法前处理中，试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素等转化为氰钴胺素，样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测。
维生素B12及其内标的液相色谱-质谱图
在对应第二法前处理中，称取试样后要先加入适量的同位素内标，再按第一法相同操作处理，最后由质谱检测器分析，因同位素内标的使用，可以有效地校正基质效应和前处理损失，使结果更加精确。
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