生物反应器助力枯草芽孢杆菌高效合成D-阿洛酮糖
2022-09-16 来源:迪必尔生物 点击次数:1808
D-阿洛酮糖是一种低热量、高甜度的己糖单糖。然而D-阿洛酮糖制备过程在碱性和高温条件下，非酶引发的褐变阻碍了D-果糖至D-果胶的转化，并且产生的副产物增加了分离和提取的难度。
为了解决生产过程中的上述问题，江南大学饶志明课题组发表的研究Efficient D-allulose synthesis under acidic conditions by auto-inducing expression of the tandem D-allulose 3-epimerase genes in Bacillus subtilis中在构建的枯草芽孢杆菌168（Bs168）内利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPEases）基因表达和自动诱导启动子工程，在酸性条件下有效合成D-阿洛酮糖。
实验首先选择枯草芽孢杆菌168作为DPEases异源表达底盘细胞，分别表征了pH和温度对纯化酶活性和稳定性的影响。纯化酶PSDPEase受温度变化影响显著，RCDPEase则具有更好的热稳定性。RCDPEase的活性受到pH变化的显著影响，而DSDPEase的活性受到的影响较小。然而当使用DSDPEase催化果糖合成D-阿洛酮糖时，发现反应混合物发生非酶褐变，并随着pH逐渐变为碱性会越来越明显。
DPEases酶学性质和碱性条件下的非酶褐变
DPEase合成D-阿洛酮糖和DPEase在一个细胞共表达的平衡时间
为了提高DPEase的表达水平，实验通过自动诱导启动子工程优化启动子。结果证实启动子优化促进了DPEase的表达。由于不同启动子在菌株中的表达机制不同，受生长时间、环境和营养等多种因素影响。因此对得到的菌株在5-L生物反应器（T&J Bio-Engineering, Shanghai）中进行分批补料培养以测试总酶表达的活性。
启动子表达对酶活性的影响
与游离酶催化相比，全细胞转化可以消除细胞破坏和纯化的步骤，更加利于工业生产。实验通过细胞密度和底物浓度优化催化的过程。在OD600=15，500 g/L果糖浓度是更加优化的全细胞转化条件。获得的产物产率高达163.5 g/L。
全细胞生物转化条件优化
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参考文献：Hu M, Wei Y, Zhang R, Shao M, Yang T, Xu M, Zhang X, Rao Z. Efficient D-allulose synthesis under acidic conditions by auto-inducing expression of the tandem D-allulose 3-epimerase genes in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2022 Apr 19;21(1):63. doi: 10.1186/s12934-022-01789-2. PMID: 35440084; PMCID: PMC9019997.