目录

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01/介绍

02/内部补料策略

    1.扩散控制补料

    2.酶控补料

    3.内部补料策略小结

03/外部补料策略

    1.自动化液体处理系统

    2.用于分批补料微生物反应器系统的微流体和微型阀技术

    3.外部补料策略小结

04/结论

 

前言

先进的分批补料微生物反应器可降低扩大规模的风险，并更接近模拟工业培养实践。近年来，已经开发了高通量微量补料策略，无论实验预算如何，都可以提高微量分批补料培养的可及性。该综述探讨了这些技术及其在加速生物过程开发中的作用。扩散和酶控制的补料可实现基质的连续供应，且简单实惠。更复杂的补料曲线和更强的过程控制需要额外的硬件。自动液体处理机器人可被编程为预定义的补料曲线，并具有响应过程参数偏差的灵敏度。
 

研究显示，微流体技术可促进连续和精确补料。将自动化高通量分批补料培养与实验设计和基于模型的优化相结合的整体方法极大地增强了过程理解，同时最大限度地减少了实验负担。为在线优化补料条件引入实时数据可进一步细化筛选。尽管该综述中讨论的技术有望实现高效、低风险的生物过程开发，但自动化培养平台的费用和复杂性限制了其广泛应用。未来的关注点应该集中在开源软件的开发上，减少硬件的排他性。
 

01介绍

许多公司依赖于不可再生的石化原料以及更复杂工艺的天然产品所需的大量步骤可能会阻碍经济可行性，将可再生原料生物转化为此类天然产物的微生物细胞工厂的建设，引起了人们的极大兴趣。

生物工艺开发的初始阶段涉及广泛筛选各种菌株和工艺参数。使用简单的批量微量滴定板(MTP)或摇瓶培养在此阶段仍然很普遍，这主要是由于与实验室规模的搅拌反应器相比，它们的成本相对较低且通量较高。然而，由于体积小和缺乏用于在线监测和控制基础设施，分析通常限于端点分析，限制了过程洞察力。

在这种情况下，先进的 微型生物反应器MBR 系统越来越多地被采用，其目的是克服这些关键的瓶颈。使用新的混合策略，尽管空间和资源要求显著降低，但仍有可能有效模拟较大的实验室生物反应器。许多装置可以并行运行，便于高通量筛选应用。通过将 MBR 技术与战实验设计(DoE)方法相结合，可以进一步最大化过程洞察力，同时最小化实验负担。DoE 促进了对生物系统中无处不在的因素相互作用的系统评估，以及对设计空间的更广泛探索。为确保工业规模的最佳性能，应在生物过程开发的早期阶段应用 DoE 同时优化遗传和环境。

微规模培养和工业规模培养之间的培养策略的主要不一致性可导致在生物过程开发的最早阶段选择次优菌株和过程条件。因此，必须将过程控制策略和分批补料操作纳入高通量筛选，以确保更接近地模拟工业规模的培养条件。

最近开发了几种具有内置补料、控制和采样能力的新型 MBR，以克服这一关键瓶颈。已经研究了创新的内部和外部补料策略及其模仿不同常用工业补料策略的潜力，例如脉冲、指数、修正指数和线性补料。内部分批补料策略包括扩散和酶控制的补料，通常涉及由半透膜分开的双相培养基和多糖基质的生物催化分解。通过使用微流体和自动化液体处理系统(LHSs)。这种系统提供了改进的补料控制，允许更有效地模仿工业相关的脉冲、线性和指数进给策略。引入基于模型的优化算法以实时分析过程数据并重新确定最佳培养策略也获得了极大的兴趣， 以进一步加快生物过程开发。

将新型分批补料 MBR 与统计 DoE 和基于模型的优化策略相结合的整体方法可能是稳健菌株开发和优化的最佳方法。通过对大量遗传和环境因素组合进行战略性高通量筛选，可以确保设计质量，同时监测和控制工业相关工艺参数。与传统方法相比，这种增加的过程洞察力有可能通过减少所需的筛选阶段的数量来大大加快生物过程的开发。

02 内部补料策略

在内部分批补料系统中，基质在培养容器内逐渐释放，无需外部补料。这些系统的主要特点是它们与现有基础设施的兼容性。由于不需要先进的微型泵、微流体或液体处理机器人技术，因此可以显著降低成本和复杂性。这种系统通常利用扩散或催化现象。

2.1扩散控制补料

扩散控制进料涉及将截留的营养物从聚合物吸附剂或通过人工膜缓慢释放。培养基中的营养物质扩散穿过半透性透析膜，然后被细胞利用。Philip 等人 2017年阐明了作为影响补料速率的关键因素的两个参数，储器中的初始基质浓度和膜几何形状。这有助于更好的补料速率控制，并且发现尽管培养体积放大了 100 倍。然而，使用透析膜的扩散控制补料方法的一个主要限制是其对摇瓶培养的限制， 这限制了生产量。
 

Jeude等人2006 年开发了 FeedBead®技术，这项技术最初也是为了在摇瓶中使用而开发的，但 Scheidle 等人 2009 年证明了 FeedBead®技术适用于 MTP 应用。Keil 等人于 2019 年开发了一种 MTP FeedPlate®系统，该系统在每个孔的底部包含一个固定的固体有机硅基质和嵌入的葡萄糖晶体。在这些 FeedPlates®中，GFP 产量提高了 245 倍。该板以 24、48 或 96 孔形式上市，允许以分批补料模式直接进行高通量培养。然而，培养基 pH、温度和渗透压等外部因素对葡萄糖释放速率有主要影响。因此，使用该技术时，对基质释放速率的精确控制受到限制。
 

2016 年，Flitsch 等人研发了一种改进的 μ-RAMOS 设备，其目的是克服原始设备的瓶颈。更新后的系统在 48 孔 MTP 的每个孔中配备了气体入口和出口阀以及光学传感器，便于对所有 48 种培养物同时进行 OTR 监测。该技术最近被进一步扩展用于 96 孔深孔 MTP，使研究人员能够实现比原始摇瓶规模的RAMOS 系统增加 15 倍的实验通量。Habicher 等人 2020 年证明了最先进的 μ- RAMOS 和 FeedPlate®对于工程化用于蛋白酶生产的地衣芽孢杆菌菌株的葡萄糖限制培养的兼容性。OTR 的在线监测极大地改善了 MTP 培养物的信息含量，发现其在 MTP 和摇瓶规模下的性能相当。使用该平台生成的数据可用于在开发的最早阶段生成数学模型，从而根据设计原则显著改善了过程质量。
 

Wilming 等人 2014 年使用 96 孔 MTP 开发了一种替代的基于扩散的分批补料系统。每个培养孔通过填充有聚丙烯酰胺水凝胶的扩散通道连接至储层孔，便于每个平板进行多达 44 次平行分批补料培养。用浓缩基质溶液填充储器，以实现逐步扩散驱动补料。通过改变储器中的浓度并由此改变驱动浓度梯度。然而， 发现补料浓度和葡萄糖释放速率之间的关系是非线性的。这种使补料速率微调复杂化的非线性归因于水的反向扩散。尽管如此，板的透明底座提供了与板读取技术兼容的主要优势，例如用于通过散射光测量生物量和荧光的 BioLector 系统(mp2-Labs，德国)。使用该系统证明了大肠杆菌和多形嗜血杆菌菌株的分批补料培养。与分批对照相比，用最佳 300g/L 葡萄糖补料进行大肠杆菌的分批补料培养分别导致生物量和基于黄素单核苷酸的荧光报告蛋白信号增加约5 倍和14 倍。
 

2.2酶控补料

淀粉在液体培养基中的溶解度差，需要在原始 EnBase®工艺中使用固相。为了消除对双相系统的需求，开发了具有完全可溶性聚合物基材的 EnBase® Flo。葡萄糖释放方法与矿物盐和复杂培养基添加剂的精心优化组合相结合，以产生高细胞密度和产品滴度。Glazyrina 等人 2012 年通过在 3mL 至 60L 的范围内培养经工程改造过量生产模型酶醇脱氢酶的大肠杆菌菌株，研究了 EnBase® Flo 系统的可扩展性。在所有测试规模下均实现了相当的增长率和蛋白质滴度，突出了可扩展性。在所有测试规模上都实现了可比的生长速率和蛋白质滴度，突出了可扩展性。EnBase®系统还提供了在大型生物反应器的初始培养阶段控制葡萄糖释放的额外好处，完全消除了溢出代谢。
 

EnBase®技术还以方便的片剂形式在市场上销售。该 EnPresso®系统与 D- optimal DoE 方法相结合，可优化 24 孔板中工程大肠杆菌的缬诺霉素生产。与原始分批培养相比，DoE 驱动的平行分批补料培养策略使缬氨霉素滴度提高了 33 倍。
 

2.3内部补料策略小结

扩散和酶控制的补料策略提供了一种相对简单和低成本的方法来模拟更大规模的分批补料过程。它们提供了恒定基质补料的关键优势，但在整个培养过程中通常不可能精确控制补料速率。结果，更复杂(例如指数)的进给曲线不能使用内部补料策略。此外，补料通常限于单一基质，这可能导致培养基中的其他营养物变得有限。特别是基于酶的补料依赖葡萄糖作为碳源，这可能不是所有过程的最佳选择。此外，在此类系统中，酸和碱补料通常是不可能的，从而限制了过程控制能力。

 

03 外部分批补料策略

在外部分批补料系统中，基质从外部储器补料。该策略的主要优点是增加了灵活性和过程控制能力。然而，由于补料需要额外的基础设施，外部分批补料系统固有地更复杂且操作成本更高。
 

3.1自动化液体处理系统

使用液体处理工作站可以实现高通量采样以及向 MTP 或平行 MBR 中添加液体。例如，RoboLector®包括集成的 BioLector®（mp2-Labs，德国）MBR 筛选平台。自动取样编程为每 24 小时一次。补料和取样均在不中断摇动的情况下实现，从而最大限度地减少对氧气传输的干扰并防止细胞沉降，从而允许获得代表性的样品。

与脉冲补料策略相关的关键挑战是缺乏连续的补料供应，这导致细胞代谢中的振荡并限制与工业规模发酵的可比性，在工业规模发酵中，指数补料策略更常用。Jansen 等人于 2019 年开发了一种自动反馈调节的基于酶的分批补料系统(FeedER)。可以通过控制添加来实现定义的指数生长速率。
 

Ambr®平台通过添加泵送液体管线，可以向每个单独的反应器中连续添加液体。克服了间歇补料的局限性，有利于实施连续补料方案和更严格的 pH 控制。
 

Bioreactor48 平台（2mag，德国）与Freedom EVO(TECAN，瑞士) LHS 相结合，以实现分批补料和过程控制。Bioreactor通过 LHS 向含有 β-呋喃果糖苷酶的培养物间歇投加蔗糖，使可代谢的果糖和葡萄糖得以连续释放。对间歇葡萄糖和酶促摄食策略的比较表明，生物量累积非常相似，但是，连续(酶促)摄食增强了 GFP 荧光。DO 振荡在间歇补料培养物中显著更大。
 

3.2 用于分批补料微生物反应器系统的微流体和微型阀技术

与自动 LHS相关的一个关键挑战是补料的间歇性。近来，微流体技术已经被实施，其目的在于开发更精确的工业过程的按比例缩小模型。微流控生物反应器系统涉及对小体积流体的受控操作。

在 Mardanpour 和 Yaghmae 研究中，使用大肠杆菌作为生物催化剂，在微流控微生物燃料电池(MFC)中以分批补料模式从葡萄糖和尿素产生生物电。为了构建微流控 MFC，使用具有单个微通道的聚甲基丙烯酸甲酯板作为主体，使用镍基阳极和负载铂的碳覆盖阴极作为主体顶部和底部的电极，通过这种方式，亲水性镍表面吸收阳极电解液并促进细胞附着，从而促进生物膜的生长。

为了确定最适合再现大型生物反应器波动条件的微流体系统，Ho 等人比较了三种广泛使用的微流体设计。该研究表明，微流体系统的设备设计在定量和灵敏地再现典型工业规模生物反应器中的不均匀性方面起着关 键作用，可能会影响分批补料系统的工艺产率。
 

微流控FlowerPlate 技术最近被用于优化谷氨酸棒杆菌的绿色荧光蛋白(GFP) 生产。Morschett 等人开发了一种高通量、并行化的 pH 控制分批补料培养工作流程，可在线监测微孔板中的生物量、pH 值、DO 和荧光。每排的两个容器中分别加入葡萄糖-尿素补料溶液和 3M 磷酸(单侧 pH 控制)。将具有不同补料策略(脉冲、恒定、指数)的分批补料工艺与标准分批工艺进行了比较。

商业微基质(Applikon Biotechnology，荷兰)平台是一种接近连续补料的替代方法，这种方法便于通过微型阀对每种单独的 μBR 进行独立的液体添加。该最先进系统基于标准 24 孔深孔板，工作体积为 2–7mL，具有集成的荧光团 pH 和溶解氧传感器，以及每个单独孔的独立气体和液体添加量。

3.3 外部补料策略总结

具有自动外部补料和严格控制工艺参数的新型 MBR 技术的最新进展，使得能够更接近地模拟工业规模的生物过程。通过自动化，实验的吞吐量和精确度得到了显著的提高。机器人 LHS 已证明了在微尺度下有效高通量分批补料培养的潜力。它们可以与现有硬件相结合，并易于编程，以实现广泛的实验应用。通过安装液体处理机器人和分析设备，对 Bioreactor 培养平台进行了改造，实现了全自动受控分批补料培养，并具有自动取样和在线样本分析功能。Mühlmann 等人的一项研究也证明了 RoboLector®平台的适应性，为了实现自动补料培养基制备和细胞培养，安装了额外的冷却器、加热器摇动器和真空站。移液操作可以预先编程以执行定义的补料配置文件并以高精度重复多次。LHS 补料的另一个限制是它的间歇性。微流体设备提供连续的补料供应，以更接近地代表工业规模条件。可以使用微流体装置分配小体积，使得它们对单个细胞的研究特别有吸引力。由于对分离细胞的研究允许将细胞内效应与细胞间或群体效应区分开来，因此这可能有利于菌株的发育。
 

具有外部补料和无创在线监测的自动化并行MBR 平台允许在相对短的时间内生成大量高质量数据集。然而，由于高设备成本和广泛的编程要求，投资比更简单的内部系统要大得多。

04 结论

在过去的十年中，微量高通量分批补料培养技术取得了长足的进步。已经开发了各种复杂性和硬件要求不同的补料机制，使得流式分批培养越来越容易获得。由于与传统的分批培养系统相比，分批补料系统可以更接近地模拟工业规模条件，因此它们可以最大限度地降低与生物工艺规模相关的风险。

尽管成本相对较低且易于实施，在整个培养过程中不可能进行精确的补料速率控制，并且补料通常仅限于单一基质。通过引入外部硬件，可以实现更复杂的补料分布和过程参数(如 pH)控制。自动液体处理机器人可被编程为响应于过程参数与指定设定点的偏差或根据预定义的补料曲线执行液体添加。最近，自动化液体处理机器人的可负担性有了显著提高，然而，为确保其广泛应用，有必要开发标准化操作程序和直观的软件，以便于其简单操作。尽管它们的高精度和灵活性很有优势，因为补料是通过间歇推注进行的，但无法实现工业相关的连续补料曲线。然而，这可以很容易地通过耦合 LHS 和酶控制的补料策略来解决。微流体技术也被开发出来，以便于非常小体积的连续精确补料。

通过将自动化的高通量分批补料培养平台与实验的战略设计和基于模型的 优化策略相结合，可以显著增强对过程的理解，同时最大限度地减少实验负担。结合实时数据来重新确定最佳补料添加和工艺控制策略显示出增强生物工艺开 发的巨大潜力。然而，关键工艺参数的在线和在线分析技术应得到改进，以充分发挥基于模型的优化，在大多数情况下，对优化至关重要的底物利用率和产物形成等参数仅限于离线分析。对传统技术（如色谱）的快速在线替代品的开发将特别有利于重新设计实验策略。

尽管该综述中讨论的技术显示出高效和低风险生物工艺开发的巨大潜力，但目前自动化培养平台的高成本和复杂性限制了它们的广泛应用。此外，这些技术和方法的标准化对于学术界和工业界的共同使用和接受至关重要，未来的工作还应侧重于开发 FOSS 和 FOSH 以提高可访问性。

 

曼森平行生物反应器分批补料应用

曼森采用Watson-malow 400A高精度泵头，16 路补料，平均每个罐有四路补料，蠕动泵流量可设定，连续可调；每个蠕动泵的功能可单独分配，可以作为酸泵、碱泵、补料泵、消泡泵、液位控制泵。

 

信息来源：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975021001944?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=747c4db53ee4ddb1
 

文章来源：本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿

排版校对：刘娟娟编辑 

内容审核：郝玉有博士

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