巨噬细胞在ibidi腔室通道载玻片培养处理活细胞与免疫荧光的应用
2022-10-17 来源:本站 点击次数:1796
下面的应用描述了小鼠巨噬细胞系RAW-264.7（生物安全等级2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室载玻片的培养方案。这是一个特殊的细胞系的例子，用于显示粘附时间，细胞密度和细胞形态的示范。这个应用可以根据于您的特殊实验要求进行调整。
2.实验材料
在设置中应用下列材料：
·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2)
· Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS
· µ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi）
· µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi）
· Accutase (PAA Laboratories GmbH)
· 1x Phosphate buffered saline (PBS)
3.细胞培养与材料制在将细胞接种到玻片之前，按照正常的方法培养细胞。
µ-Slide VI 0.4：通道玻片和培养基，在37℃和5% Co2培养箱中培养过夜。这是必不可少的，以避免气泡随着时间的推移出现。为此，在50毫升容器中填充适当量的培养基，并将瓶盖稍微拧紧。在一个开放的形式，如用µ-Slide 8 well，气泡可以出来到大气中。
拆下µ-Slide，把它放在一个滑动架上，在准备细胞悬浮液的同时将盖子分别放在 Luer 适配器/孔上
分离细胞：
吸出培养瓶中的培养基，并用PBS洗涤细胞一次。每75cm²烧瓶中加入3-5 ml的Accutase，并将烧瓶放入培养箱中以加快分离速度。如果是RAW-264.7细胞系，则大约需要8分钟。使用Accutase分离的细胞存活率更高。
4.1. 将细胞接种到µ-Slide VI0.4中
µ-Slide VI0.4的推荐细胞浓度：对于最终的细胞数为 0.3 x 10 5cells/cm²，准备 6 x 10 5 cells/ml的浓度。通过移液器吸头把30 µl细胞悬浮液填充到每个通道中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小时以固定细胞。
细胞附着后，分别用60 µl无细胞培养基填充储槽。避免将移液器吸头直接指向通道的入口。将玻片放回培养箱中。
图1：接种后一小时，在ibiTreat µ-Slide VI0.4(货号80606）中的RAW-264.7。
图2: 在ibiTreat µ-Slide VI0.4中孵育24小时后的RAW-264.7
图3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培养四天后。
4.2 将细胞播种在µ-Slide 8 well 中
在µ-Slide 8 well建议的细胞浓度：最终细胞数 0.3 x 10 5 cells/cm² ，制备浓度 1.1 x 10 5 cells/ml。将300 µl 的细胞悬浮液注入各孔中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5% Co2中孵育。不需要进一步添加培养基。
图4：在ibiTreat µ-Slide 8 well（货号80826）中的RAW-264.7，播种后1小时。
图5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小时后。
图6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，经过四天的培养
对于一个最佳的均匀细胞分布，我们建议使用通道µ-Slide VI 0.4。在8孔腔室载玻片中，取决于在细胞播种过程中的处理，细胞密度的整个表面上因点而异。
5.免疫荧光染色
像往常一样为您的细胞固定和染色。
下面，用下列材料对细胞核和肌动蛋白丝染色进行一个例子：
细胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670
肌动蛋白丝：Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010
1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室温下固定细胞10分钟。
2. 用PBS清洗细胞三次。
3. 用Triton X 100（0.1%）孵育细胞5分钟。
4. 用PBS清洗细胞三次。
5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分钟。
6. 用PBS清洗细胞三次。
7. 在0.2μm浓度下用鬼笔环肽Alexa For 488孵育细胞20分钟。
8. 用PBS清洗细胞三次。
9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育细胞10分钟。
10. 用PBS清洗细胞三次。
11.完全吸出通道液体，并用ibidi封片剂重新填充，样品现在可以在显微镜下观察了，在阴暗阴凉处可储存数周。
图7：在 µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7用DAPI（细胞核、蓝色）和Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate（肌动蛋白丝，绿色）
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