实时活细胞成像在多参数药理学筛选中的应用
2022-11-16 来源:本站 点击次数:2775
对人类活动的动态记录促使了抖音等视频的大流行，同样的，对科学的观察和记录也有同样的追求，正在从静态的“快照”观察转向对活体动态过程的描述。以实现发现和监测为目的的活细胞成像正是目前研究动物细胞增殖的理想手段，能帮助生物学家更好地了解实验条件可能对不同系统中细胞增殖的影响。
本文中，我们将展示使用高通量活细胞成像平台CELLCYTE X™如何方便地获得多孔板中细胞的全面、长时间、多参数和实时的状态，并证实，CELLCYTE X™基于轮廓增强的细胞汇合百分比与荧光信号强度和核或细胞计数指标相结合，可成功用于表征药物在人和鼠不同细胞类型中的药理学特征。
CELLCYTE X 在药理学筛选中的应用
实验背景
细胞增殖是基础研究和转化研究，尤其是免疫肿瘤学应用药物发现中的关键指标。细胞增殖的变化通常通过终点测定来评估，例如通过核苷类似物BrdU和EdU的掺入来定量DNA合成，或通过分析增殖报告蛋白的表达，例如Ki-67和增殖细胞核抗原（PCNA）。但在近来20年，活细胞成像已被证实是评估细胞增殖的一种更加优越的技术，因为它依赖于在培养箱中数天或数周的生长细胞图像的采集和分析，从而提供受控的、一致的环境条件下细胞群的实时数据。
在此，我们演示了CELLCYTE X™如何使用多个参数实时监测细胞增殖，详细介绍如何通过使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的无标记融合测量或通过表达荧光团细胞的多参数分析，定量和定性评估不同药物的药理学。
实验结果
1. 细胞增殖的多参数分析
以CELLCYTE X™增强轮廓（EC）的高对比度亮场形式和绿色（绿色FL）、红色（红色FL）荧光通道对生长中的视网膜色素上皮-1（RPE-1）细胞成像，分别监测核和细胞质荧光团的表达。然后使用CELLCYTE X软件同时分析这些图像，以便以EC汇合百分比、绿色FL细胞计数和红色FL细胞核计数的形式推断细胞增殖的定量测量（图1）。
同时测量多个荧光信号的能力使CELLCYTE X™成为实时分析共培养系统的理想平台（图2）。
通过使用荧光汇流面积百分比衡量指标，分析表达绿色或红色荧光团的乳腺癌细胞系的增殖情况(图2B)。每个视场的荧光物体计数表明GFP表达细胞具有优越的增殖能力（图2C）。荧光强度(a.u)指标更全面地反映了个体细胞随时间的增殖行为（图2D和2E）。实际上，总体红色荧光强度表明，尽管表达mCherry的细胞增殖较低，但荧光信号强度与GFP信号相当（图2D）。这可以通过单个荧光指标来解释，可以从图2E中所示的随时间变化的种群平均水平进行分析，也可以从图2F中所示的所有图像的单个细胞水平进行分析，证实了表达mcherry的细胞数量较少，但与表达GFP的细胞相比，它们发出的荧光信号却更强烈。
使用CELLCYTE X Studio Software，用户还可以调整荧光掩膜灵敏度，只检测表达一定荧光团水平的细胞，这在培养表现不同表达程度的异质细胞群体时非常有用。通过利用这些指标，可以在高通量设计中解释可变荧光团表达，如应用在CRISPR/Cas9 gRNA文库或facs排序细胞的基因筛选中。
2. 抑制细胞增殖药物的无标记剂量反应分析
剂量反应分析是评估药物研发过程中各种化合物作用的关键工具，特别是在评估药物对不同类型细胞增殖的影响时。CELLCYTE X™增强轮廓成像方式是一种高对比度亮场显微镜，可用于获得精确的无标记细胞汇流测量。
为了验证细胞汇合衡量指标对高通量筛选平台的适用性，我们监测了在96孔板中用Cycloheximide（一种常用的细胞毒性蛋白合成抑制剂）和喜树碱（一种DNA拓扑异构酶I抑制剂）处理的MEF细胞的增殖情况。
为了评估EC汇流衡量指标的敏感性和粒度的可译性，我们获得这两种药物的1:3稀释剂量-反应曲线，覆盖从0.123 μ M到10 μ M 2-log的浓度范围。喜树碱和Cycloheximide治疗均获得了稳健的化合物浓度依赖性剂量反应（图3）。喜树碱处理的MEF，特别是在较低剂量时，显示出在应用该化合物后的前6小时内汇合度增加。随后，细胞毒性作用很快显现出来。在浓度为0.123µM时，细胞汇合稳定下降，在浓度为1.11µM至10µM的情况下，汇合呈动力学等效指数下降（图3A）。另一方面，经Cycloheximide处理的细胞表现出更大范围的细胞毒性动力学。虽然在前3小时内也观察到汇合度略有增加，但随后是一个较慢且较稳定的下降，在浓度峰值时看到的动力学更快(图3B)。
这些化合物的不同效力反映在它们的IC50中，该浓度是用48小时的细胞汇合数据计算的。MEF细胞显然对喜树碱（IC50=0.15µM，CI95 0.12–0.17µM）比Cycloheximide（IC50=1.15µM，CI95 1.03–1.48）更敏感（图3C）。
这一定量数据表明Cycloheximide的药理学窗口更宽，也反映在定性形态学变化中，可以通过CELLCYTE X™生成的高分辨率EC图像进行识别（图4）。虽然在1.11 μ M下，两种药物在6小时内似乎都不会影响典型的成纤维细胞形态，但在48小时内却有明显的差异。使用喜树碱，可以通过四舍五入的高对比度细胞的形式看到广泛的细胞死亡。
为了更准确地反映药物的细胞毒性，用于EC合流定量的掩膜被设置为不识别大量碎片(图4，右中)。另一方面，Cycloheximide引起的蛋白质合成抑制不仅表现为EC汇合所量化的中度增殖抑制，而且在形态学上表现为高对比度核周结构的广泛积累（图4，右下角），这些特征可以通过高分辨率EC图像来识别。
3. 使用增强型轮廓汇流和荧光通道衡量指标的复合物筛选
前瞻性抗增殖药物库的筛选通常通过高通量设置中的分析来完成，其中单个指标反映了在预定终点对细胞健康的不同测量。通过使用CELLCYTE X™的增强轮廓和荧光成像模式，可以使用多种指标实时评估药物治疗对细胞增殖的影响。
为了验证CELLCYTE X™在合理准确量化细胞增殖方面的能力，我们用广泛浓度的细胞毒性药物治疗了快速生长的乳腺癌细胞系，并使用仪器的EC和绿色荧光通道对其进行实时成像。组成性表达GFP蛋白的MDA-MB-231细胞用从156nM至20µM的Staurosporine和喜树碱的1:2稀释剂量-反应曲线处理。Staurosporine是一种有效的蛋白激酶抑制剂，通过Caspase-3介导的凋亡诱导细胞死亡。
如图5A和5D所示，Staurosporine和喜树碱均在6至12小时后达到峰值，随后在接下来的3天内缓慢但稳定地下降，尤其是在高剂量下。使用CELLCYTE Studio软件采集和分析荧光图像，获得绿色强度（图5B和5E）和绿色物体计数指标（图5C和5F。事实上，这两个参数对这些药物的效果提供了一个互补的观点。
Staurosporine处理的细胞(图5B)的绿色强度反映了GFP的整体表达程度，在最初的6- 12小时内保持不变，并稳步下降，而对照处理的细胞则显示出6倍的增长。对于喜树碱，在3个数据中，细胞表现出更微妙的剂量依赖性恒定动力学(图5E)。第三个感兴趣的指标是绿色物体计数，与强度相反，Staurosporine（图5C）比喜树碱（图5F）表现出更颗粒的剂量依赖性行为。
这3个指标提供了一组不同但互补的定量测量，可以通过检查采集和分析的图像进行协调。
经Staurosporine处理的细胞在10小时后呈现出明显的星状形态(图6)。因此EC -汇流掩膜(图6)高估了总体占据面积的增加。随着时间的推移，细胞生长确实受到了抑制，尽管有星形形态，但EC融合度指标仍然可以观察到广泛的细胞死亡，该指标描述了前10小时后的稳定下降。
在这种情况下，需要考虑的补充指标是荧光信号。当检查绿色荧光时，Staurosporine处理的细胞中凋亡小体中GFP的积累解释了绿色物体数量的增加，如图5C和图6所示。在接下来的几天里，随着膜完整性的完全丧失和坏死，荧光物数量以一种更依赖剂量的方式迅速减少，在staurosporin处理的细胞中，72小时后可以看到最小的信号(图6)。
实验结论
本研究已经证明，高通量活细胞成像平台CELLCYTE X™可以为药理学筛选提供自动化的、连续的动态细胞生长分析:
参考文献
1. Lawana V, Korrapati MC, Mehendale HM. Cycloheximide. In Wexler P,ed. Encyclopedia of Toxicology. 3rd ed. Academic Press; 2014: 1103–1105. DOI:10.1016/B978-0-12-386454-3.00298-0.
2. DrugBank Online. Camptothecin. Accessed 12 October 2021. https://go.drugbank.com/drugs/DB04690.
3. Eidet JR, Pasovic L, Maria R, et al. Objective assessment of changes in nuclear morphology and cell distribution following induction of apoptosis. Diagnostic Pathology. 2014; 9(1): 92. DOI:10.1186/1746-1596-9-92.
4. Deshmukh M, Johnson EM. Staurosporine-induced neuronal death: multiple mechanisms and methodological implications. Cell Death & Differentiation. 2000; 7(3): 250–261. DOI:10.1038/sj.cdd.4400641.
5. Yang R, Fu W, Wang S, et al. Mechanism of the morphological changes induced by staurosporine in rat osteoblasts. Calcified Tissue International. 1997; 61: 68–73. DOI:10.1007/s002239900297.
6. Tharanga Jayasooriya R, Gayani Dilshara M, Neelaka Molagoda I,et al. Camptothecin induces G2/M phase arrest through the ATM-Chk2-Cdc25C axis as a result of autophagy-induced cytoprotection: Implications of reactive oxygen species. Oncotarget. 2018; 9(31): 21744–21757.DOI:10.18632/oncotarget.24934.
本文中，我们将展示使用高通量活细胞成像平台CELLCYTE X™如何方便地获得多孔板中细胞的全面、长时间、多参数和实时的状态，并证实，CELLCYTE X™基于轮廓增强的细胞汇合百分比与荧光信号强度和核或细胞计数指标相结合，可成功用于表征药物在人和鼠不同细胞类型中的药理学特征。
CELLCYTE X 在药理学筛选中的应用
实验背景
细胞增殖是基础研究和转化研究，尤其是免疫肿瘤学应用药物发现中的关键指标。细胞增殖的变化通常通过终点测定来评估，例如通过核苷类似物BrdU和EdU的掺入来定量DNA合成，或通过分析增殖报告蛋白的表达，例如Ki-67和增殖细胞核抗原（PCNA）。但在近来20年，活细胞成像已被证实是评估细胞增殖的一种更加优越的技术，因为它依赖于在培养箱中数天或数周的生长细胞图像的采集和分析，从而提供受控的、一致的环境条件下细胞群的实时数据。
在此，我们演示了CELLCYTE X™如何使用多个参数实时监测细胞增殖，详细介绍如何通过使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的无标记融合测量或通过表达荧光团细胞的多参数分析，定量和定性评估不同药物的药理学。
实验结果
1. 细胞增殖的多参数分析
以CELLCYTE X™增强轮廓（EC）的高对比度亮场形式和绿色（绿色FL）、红色（红色FL）荧光通道对生长中的视网膜色素上皮-1（RPE-1）细胞成像，分别监测核和细胞质荧光团的表达。然后使用CELLCYTE X软件同时分析这些图像，以便以EC汇合百分比、绿色FL细胞计数和红色FL细胞核计数的形式推断细胞增殖的定量测量（图1）。
同时测量多个荧光信号的能力使CELLCYTE X™成为实时分析共培养系统的理想平台（图2）。
通过使用荧光汇流面积百分比衡量指标，分析表达绿色或红色荧光团的乳腺癌细胞系的增殖情况(图2B)。每个视场的荧光物体计数表明GFP表达细胞具有优越的增殖能力（图2C）。荧光强度(a.u)指标更全面地反映了个体细胞随时间的增殖行为（图2D和2E）。实际上，总体红色荧光强度表明，尽管表达mCherry的细胞增殖较低，但荧光信号强度与GFP信号相当（图2D）。这可以通过单个荧光指标来解释，可以从图2E中所示的随时间变化的种群平均水平进行分析，也可以从图2F中所示的所有图像的单个细胞水平进行分析，证实了表达mcherry的细胞数量较少，但与表达GFP的细胞相比，它们发出的荧光信号却更强烈。
使用CELLCYTE X Studio Software，用户还可以调整荧光掩膜灵敏度，只检测表达一定荧光团水平的细胞，这在培养表现不同表达程度的异质细胞群体时非常有用。通过利用这些指标，可以在高通量设计中解释可变荧光团表达，如应用在CRISPR/Cas9 gRNA文库或facs排序细胞的基因筛选中。
2. 抑制细胞增殖药物的无标记剂量反应分析
剂量反应分析是评估药物研发过程中各种化合物作用的关键工具，特别是在评估药物对不同类型细胞增殖的影响时。CELLCYTE X™增强轮廓成像方式是一种高对比度亮场显微镜，可用于获得精确的无标记细胞汇流测量。
为了验证细胞汇合衡量指标对高通量筛选平台的适用性，我们监测了在96孔板中用Cycloheximide（一种常用的细胞毒性蛋白合成抑制剂）和喜树碱（一种DNA拓扑异构酶I抑制剂）处理的MEF细胞的增殖情况。
为了评估EC汇流衡量指标的敏感性和粒度的可译性，我们获得这两种药物的1:3稀释剂量-反应曲线，覆盖从0.123 μ M到10 μ M 2-log的浓度范围。喜树碱和Cycloheximide治疗均获得了稳健的化合物浓度依赖性剂量反应（图3）。喜树碱处理的MEF，特别是在较低剂量时，显示出在应用该化合物后的前6小时内汇合度增加。随后，细胞毒性作用很快显现出来。在浓度为0.123µM时，细胞汇合稳定下降，在浓度为1.11µM至10µM的情况下，汇合呈动力学等效指数下降（图3A）。另一方面，经Cycloheximide处理的细胞表现出更大范围的细胞毒性动力学。虽然在前3小时内也观察到汇合度略有增加，但随后是一个较慢且较稳定的下降，在浓度峰值时看到的动力学更快(图3B)。
这些化合物的不同效力反映在它们的IC50中，该浓度是用48小时的细胞汇合数据计算的。MEF细胞显然对喜树碱（IC50=0.15µM，CI95 0.12–0.17µM）比Cycloheximide（IC50=1.15µM，CI95 1.03–1.48）更敏感（图3C）。
这一定量数据表明Cycloheximide的药理学窗口更宽，也反映在定性形态学变化中，可以通过CELLCYTE X™生成的高分辨率EC图像进行识别（图4）。虽然在1.11 μ M下，两种药物在6小时内似乎都不会影响典型的成纤维细胞形态，但在48小时内却有明显的差异。使用喜树碱，可以通过四舍五入的高对比度细胞的形式看到广泛的细胞死亡。
为了更准确地反映药物的细胞毒性，用于EC合流定量的掩膜被设置为不识别大量碎片(图4，右中)。另一方面，Cycloheximide引起的蛋白质合成抑制不仅表现为EC汇合所量化的中度增殖抑制，而且在形态学上表现为高对比度核周结构的广泛积累（图4，右下角），这些特征可以通过高分辨率EC图像来识别。
3. 使用增强型轮廓汇流和荧光通道衡量指标的复合物筛选
前瞻性抗增殖药物库的筛选通常通过高通量设置中的分析来完成，其中单个指标反映了在预定终点对细胞健康的不同测量。通过使用CELLCYTE X™的增强轮廓和荧光成像模式，可以使用多种指标实时评估药物治疗对细胞增殖的影响。
为了验证CELLCYTE X™在合理准确量化细胞增殖方面的能力，我们用广泛浓度的细胞毒性药物治疗了快速生长的乳腺癌细胞系，并使用仪器的EC和绿色荧光通道对其进行实时成像。组成性表达GFP蛋白的MDA-MB-231细胞用从156nM至20µM的Staurosporine和喜树碱的1:2稀释剂量-反应曲线处理。Staurosporine是一种有效的蛋白激酶抑制剂，通过Caspase-3介导的凋亡诱导细胞死亡。
如图5A和5D所示，Staurosporine和喜树碱均在6至12小时后达到峰值，随后在接下来的3天内缓慢但稳定地下降，尤其是在高剂量下。使用CELLCYTE Studio软件采集和分析荧光图像，获得绿色强度（图5B和5E）和绿色物体计数指标（图5C和5F。事实上，这两个参数对这些药物的效果提供了一个互补的观点。
Staurosporine处理的细胞(图5B)的绿色强度反映了GFP的整体表达程度，在最初的6- 12小时内保持不变，并稳步下降，而对照处理的细胞则显示出6倍的增长。对于喜树碱，在3个数据中，细胞表现出更微妙的剂量依赖性恒定动力学(图5E)。第三个感兴趣的指标是绿色物体计数，与强度相反，Staurosporine（图5C）比喜树碱（图5F）表现出更颗粒的剂量依赖性行为。
这3个指标提供了一组不同但互补的定量测量，可以通过检查采集和分析的图像进行协调。
经Staurosporine处理的细胞在10小时后呈现出明显的星状形态(图6)。因此EC -汇流掩膜(图6)高估了总体占据面积的增加。随着时间的推移，细胞生长确实受到了抑制，尽管有星形形态，但EC融合度指标仍然可以观察到广泛的细胞死亡，该指标描述了前10小时后的稳定下降。
在这种情况下，需要考虑的补充指标是荧光信号。当检查绿色荧光时，Staurosporine处理的细胞中凋亡小体中GFP的积累解释了绿色物体数量的增加，如图5C和图6所示。在接下来的几天里，随着膜完整性的完全丧失和坏死，荧光物数量以一种更依赖剂量的方式迅速减少，在staurosporin处理的细胞中，72小时后可以看到最小的信号(图6)。
实验结论
本研究已经证明，高通量活细胞成像平台CELLCYTE X™可以为药理学筛选提供自动化的、连续的动态细胞生长分析:
- EC汇合率、细胞核计数和细胞计数用于监测细胞增殖。
- 多个荧光通道可在共培养系统中进行灵活的细胞增殖分析。
- 通过定性形态学分析以及EC合流率、荧光强度信号和荧光物计数的定量测量，实现了全面的药理评价。
参考文献
1. Lawana V, Korrapati MC, Mehendale HM. Cycloheximide. In Wexler P,ed. Encyclopedia of Toxicology. 3rd ed. Academic Press; 2014: 1103–1105. DOI:10.1016/B978-0-12-386454-3.00298-0.
2. DrugBank Online. Camptothecin. Accessed 12 October 2021. https://go.drugbank.com/drugs/DB04690.
3. Eidet JR, Pasovic L, Maria R, et al. Objective assessment of changes in nuclear morphology and cell distribution following induction of apoptosis. Diagnostic Pathology. 2014; 9(1): 92. DOI:10.1186/1746-1596-9-92.
4. Deshmukh M, Johnson EM. Staurosporine-induced neuronal death: multiple mechanisms and methodological implications. Cell Death & Differentiation. 2000; 7(3): 250–261. DOI:10.1038/sj.cdd.4400641.
5. Yang R, Fu W, Wang S, et al. Mechanism of the morphological changes induced by staurosporine in rat osteoblasts. Calcified Tissue International. 1997; 61: 68–73. DOI:10.1007/s002239900297.
6. Tharanga Jayasooriya R, Gayani Dilshara M, Neelaka Molagoda I,et al. Camptothecin induces G2/M phase arrest through the ATM-Chk2-Cdc25C axis as a result of autophagy-induced cytoprotection: Implications of reactive oxygen species. Oncotarget. 2018; 9(31): 21744–21757.DOI:10.18632/oncotarget.24934.
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