《Nature子刊》：组合式液滴微流控平台助力生物分子凝聚体研究
2022-12-26 来源:本站 点击次数:2459
生物分子组装成凝聚体是细胞内空间组织和细胞功能调节的一个基本过程。绘制和描述生物分子的相行为对理解凝聚体的组装机制和开发针对生物分子凝聚体系统治疗策略至关重要。描述相分离系统的一个核心概念是相图。相图通常是通过对参数空间不同部分进行大量单独测量来建立。但是即使在微孔板格式下进行，过程也是缓慢，低通量的，需要大量的样品消耗。
近日，来自英国剑桥大学的Tuomas P. J. Knowles教授团队进行了组合式液滴微流控平台的生物分子凝聚体相图相关研究。研究成果以“Biomolecular condensate phase diagrams with a combinatorial microdroplet platform”为题于2022年12月21日发表在《Nat. Commun.》上。
本文提出了一个组合式液滴微流控平台，称为PhaseScan，用于快速和高分辨率获取多维生物分子相图。利用该平台对各种条件下系统的相行为进行分析，并证明PhaseScan可以定量分析小分子物质对生物分子相变的影响。
图1 相位扫描工作流程
微液滴生成和成像的工作流程：作为一个模型系统，研究人员利用EGFP标记的G156E突变体-肉瘤融合蛋白，即肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）病理蛋白，可用于相分离研究。通过蛋白质EGFP标签观察冷凝物的存在与否，将液滴分为相分离或相均匀。通常情况下，算法的假阳性和假阴性分类误差总和<4%。凝聚体随时间的推移而合并，与光漂白（FRAP）实验后的片外荧光恢复证实了PhaseScan实验中形成的凝聚体液体性质。通过将确定浓度和相分离存在或不存在以每一液滴为基础的散点图结合，产生一个相图。作为EGFP-FUSG156E和PEG浓度的函数，相边界的位置和相分离的概率通过支持向量机（SVM）算法对相分离或同质液滴的散点图群体训练确定。相分离系统表现为动态变化，凝结液滴在成核后由于生长、凝聚和奥斯特瓦尔德成熟而不断演变。同时研究液滴大小影响相界位置的可能性发现，液滴体积有调节成核驱动的凝结物生长动态倾向，PhaseScan实验报告的是相界的平衡位置，对液滴体积不敏感。
图2 PhaseScan在不同冷凝水系统中的应用
验证完PhaseScan系统操作后，研究人员图利用平台研究不同相分离系统，并测试该方法对同型和异型凝集物系统的通用性。由于核酸共存是相分离核糖核蛋白颗粒的一个决定性特征，首先制作EGFP标记的FUSG156E在有polyU RNA情况下的凝集相图，FUSG156E相对于RNA低比例下没有检测到相分离，在较高FUSG156E浓度下发生相分离。研究表明凝结物的形成和蛋白质-RNA共存是通过电荷中和发生，因此凝结是在RNA与蛋白质离散比率下发生的。
为证明PhaseScan系统对其他相分离蛋白的适用性，对EGFP标记的G3BP1的拥挤驱动相分离进行表征，结果显示G3BP1的相分离在高浓度PEG分子拥挤剂中出现，在更高蛋白浓度下得到加强。接着研究人员探测了人类冠状病毒SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 N）核衣壳蛋白的相分离，结果显示：相分离以RNA依赖方式进行，SARS-CoV-2 N相分离可以由RNA存在驱动，过量核酸浓度会导致冷凝液的溶解。总之，以上实验证明PhaseScan方法适用于广泛冷凝液系统。该检测方法可用于表征全长蛋白质同型和异型相分离，包括观察蛋白质-RNA共沉淀物中的再入相分离行为。
图3 利用PhaseScan探测小分子调节剂对相分离的影响
接着研究小分子对相分离的影响。由于冷凝物形成过程与多种疾病有关，包括神经退行性疾病和癌症。本研究关键在于提供高分辨率相图，以准确量化小分子调节剂对相分离平衡影响。使用小分bis-ANS对FUSG156E相分离调节，该化合物是各种相分离蛋白有效调节剂。在双ANS的存在下，相界的位置明显向低蛋白和低PEG浓度移动。总之，PhaseScan方法对小分子添加后蛋白质LLPS行为的变化提供高分辨率评估。许多候选分子的影响是微小的，从一个候选小组中识别潜在物质命中率需要高检测分辨率。PhaseScan以最小样品消耗实现高检测分辨率，为高内容库的筛选提供有效方式。
图4 使用PhaseScan平台生成多维相图
环境因素可以触发或调节生物分子相分离。但对环境影响的研究通常局限于二维化学空间分析，PhaseScan平台能够自动和高通量地生成大量溶液条件，对FUSG156E进行一个三维（3D）参数空间PhaseScan实验。在高蛋白和PEG浓度下，相分离更有利。同时在较高浓度1,6-HD下，相分离会减少，因为1,6-HD会通过争夺主要驱动蛋白质LLPS的疏水相互作用来破坏蛋白质凝聚物。作为蛋白浓度的函数，分子拥挤和1,6-HD对相分离的拮抗作用可以同时观察。PhaseScan平台在一次实验中评估相分离多种调节剂的能力，提供一种方便、高分辨率的手段，可用最小的样品消耗来研究相分离机理变化。
总之，本文进行了组合式液滴微流控平台的生物分子凝聚体相图相关研究。生物分子凝聚已经改变了我们对细胞生物学的理解。PhaseScan平台通过应用微流控技术，为快速、高分辨率获得LLPS相图提供了基础。PhaseScan方法适用于广泛相分离系统，包括共存肽、人类蛋白和病毒蛋白，提供了一个有价值的工具，能够快速、高分辨率分析相分离过程。PhaseScan还能提供高分辨率的相图，以准确量化小分子调节剂对相分离平衡的影响。同时PhaseScan还允许在一次实验中探索更高维化学空间。本平台在筛选候选小分子方面可以实现多种药物-蛋白质组合的快速筛选。未来实验可以通过将高频液滴生成与快速显微镜技术相结合，实现更好的检测产量，为高分辨率和高通量探索蛋白质和核酸在各种条件下的相位变化开辟了一条道路。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35265-7
近日，来自英国剑桥大学的Tuomas P. J. Knowles教授团队进行了组合式液滴微流控平台的生物分子凝聚体相图相关研究。研究成果以“Biomolecular condensate phase diagrams with a combinatorial microdroplet platform”为题于2022年12月21日发表在《Nat. Commun.》上。
本文提出了一个组合式液滴微流控平台，称为PhaseScan，用于快速和高分辨率获取多维生物分子相图。利用该平台对各种条件下系统的相行为进行分析，并证明PhaseScan可以定量分析小分子物质对生物分子相变的影响。
微液滴生成和成像的工作流程：作为一个模型系统，研究人员利用EGFP标记的G156E突变体-肉瘤融合蛋白，即肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）病理蛋白，可用于相分离研究。通过蛋白质EGFP标签观察冷凝物的存在与否，将液滴分为相分离或相均匀。通常情况下，算法的假阳性和假阴性分类误差总和<4%。凝聚体随时间的推移而合并，与光漂白（FRAP）实验后的片外荧光恢复证实了PhaseScan实验中形成的凝聚体液体性质。通过将确定浓度和相分离存在或不存在以每一液滴为基础的散点图结合，产生一个相图。作为EGFP-FUSG156E和PEG浓度的函数，相边界的位置和相分离的概率通过支持向量机（SVM）算法对相分离或同质液滴的散点图群体训练确定。相分离系统表现为动态变化，凝结液滴在成核后由于生长、凝聚和奥斯特瓦尔德成熟而不断演变。同时研究液滴大小影响相界位置的可能性发现，液滴体积有调节成核驱动的凝结物生长动态倾向，PhaseScan实验报告的是相界的平衡位置，对液滴体积不敏感。
验证完PhaseScan系统操作后，研究人员图利用平台研究不同相分离系统，并测试该方法对同型和异型凝集物系统的通用性。由于核酸共存是相分离核糖核蛋白颗粒的一个决定性特征，首先制作EGFP标记的FUSG156E在有polyU RNA情况下的凝集相图，FUSG156E相对于RNA低比例下没有检测到相分离，在较高FUSG156E浓度下发生相分离。研究表明凝结物的形成和蛋白质-RNA共存是通过电荷中和发生，因此凝结是在RNA与蛋白质离散比率下发生的。
为证明PhaseScan系统对其他相分离蛋白的适用性，对EGFP标记的G3BP1的拥挤驱动相分离进行表征，结果显示G3BP1的相分离在高浓度PEG分子拥挤剂中出现，在更高蛋白浓度下得到加强。接着研究人员探测了人类冠状病毒SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 N）核衣壳蛋白的相分离，结果显示：相分离以RNA依赖方式进行，SARS-CoV-2 N相分离可以由RNA存在驱动，过量核酸浓度会导致冷凝液的溶解。总之，以上实验证明PhaseScan方法适用于广泛冷凝液系统。该检测方法可用于表征全长蛋白质同型和异型相分离，包括观察蛋白质-RNA共沉淀物中的再入相分离行为。
接着研究小分子对相分离的影响。由于冷凝物形成过程与多种疾病有关，包括神经退行性疾病和癌症。本研究关键在于提供高分辨率相图，以准确量化小分子调节剂对相分离平衡影响。使用小分bis-ANS对FUSG156E相分离调节，该化合物是各种相分离蛋白有效调节剂。在双ANS的存在下，相界的位置明显向低蛋白和低PEG浓度移动。总之，PhaseScan方法对小分子添加后蛋白质LLPS行为的变化提供高分辨率评估。许多候选分子的影响是微小的，从一个候选小组中识别潜在物质命中率需要高检测分辨率。PhaseScan以最小样品消耗实现高检测分辨率，为高内容库的筛选提供有效方式。
环境因素可以触发或调节生物分子相分离。但对环境影响的研究通常局限于二维化学空间分析，PhaseScan平台能够自动和高通量地生成大量溶液条件，对FUSG156E进行一个三维（3D）参数空间PhaseScan实验。在高蛋白和PEG浓度下，相分离更有利。同时在较高浓度1,6-HD下，相分离会减少，因为1,6-HD会通过争夺主要驱动蛋白质LLPS的疏水相互作用来破坏蛋白质凝聚物。作为蛋白浓度的函数，分子拥挤和1,6-HD对相分离的拮抗作用可以同时观察。PhaseScan平台在一次实验中评估相分离多种调节剂的能力，提供一种方便、高分辨率的手段，可用最小的样品消耗来研究相分离机理变化。
总之，本文进行了组合式液滴微流控平台的生物分子凝聚体相图相关研究。生物分子凝聚已经改变了我们对细胞生物学的理解。PhaseScan平台通过应用微流控技术，为快速、高分辨率获得LLPS相图提供了基础。PhaseScan方法适用于广泛相分离系统，包括共存肽、人类蛋白和病毒蛋白，提供了一个有价值的工具，能够快速、高分辨率分析相分离过程。PhaseScan还能提供高分辨率的相图，以准确量化小分子调节剂对相分离平衡的影响。同时PhaseScan还允许在一次实验中探索更高维化学空间。本平台在筛选候选小分子方面可以实现多种药物-蛋白质组合的快速筛选。未来实验可以通过将高频液滴生成与快速显微镜技术相结合，实现更好的检测产量，为高分辨率和高通量探索蛋白质和核酸在各种条件下的相位变化开辟了一条道路。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35265-7
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