实验描述了将斑马鱼幼虫包埋在低百分比低熔点琼脂糖中用于延时显微镜的过程。根据科学问题，可以在琼脂糖包埋的幼虫中观察到不同的发育阶段：这可以包括绒毛膜发育的最初 48 小时，或孵化后的时间（受精后 48-120 小时）。
 

•斑马鱼幼虫（受精后长达 120 小时）

•热混合器（例如 Eppendorf、ThermoMixer C）

•µ-Slide 2 孔共培养，ibiTreat（81806）

•塑料移液器

•可选：小刷子

•显微镜
 

在开始实验之前，请按照“缓冲区和解决方案”部分中的说明准备 LMPA。保持在 35°C 直至需要。如果预先准备好琼脂糖，请在热混合器中重新加热等分试样 (~80°C)，然后让琼脂糖冷却 (~35°C)。

请在使用 µ-Slide 2 Well Co-Culture 之前阅读说明。

在我们小组的一些实验中，机械损伤被诱导到斑马鱼脊髓。如果这样做，建议让幼虫在安装前至少恢复 30 分钟。脊髓横断后，嵌入琼脂糖后的初始存活率为 80%。所有这些幼虫也在琼脂糖中存活了 48 小时的观察期。未受伤幼虫的初始存活率接近 100%。

1.在 Tricaine Use Solution 中麻醉斑马鱼幼虫 2 分钟。

2.使用塑料移液器将一只幼虫放入每个 µ-Slide 2 孔共培养室中，加入一点多余的鱼水。

3.对每个幼虫分别执行以下步骤（以避免变干）：

3.1.用塑料移液管去除所有鱼水。

3.2.将 50 µl LMPA 添加到小孔中以覆盖幼虫。

3.3.使用刷子或小移液器吸头，将幼虫定向到正确的位置（横向位置，尽可能水平和笔直，对齐均匀，即始终面向左侧，蛋黄在底部）。

4.让 LMPA 凝胶凝固（0.5% 凝胶 ~ 20–30 分钟）。

5.可选：用600µl 1x含80 mg/l三卡因原液的鱼水覆盖固化的LMPA凝胶，用于在成像过程中进行连续麻醉。

6.用自带盖子盖住 µ-Slide 2 Well Co-Culture 以避免蒸发。

7.安装的斑马鱼幼虫现在可以进行成像了。

在琼脂糖顶部添加鱼水是可选的，因为如果盖子紧闭，标本在 48 小时的成像过程中不会变干。这也使正置显微镜观察没有溢出的风险。
 

图 1：在 µ-Slide 2 Well Co-Culture 中嵌入 LMPA 的斑马鱼幼虫
 

这种样品制备程序可用于连续延时显微镜以及不同时间点的某些视野的光学显微镜设备。

图 2：A) 整个 µ-Slide 2 Well Co-Culture 与总共 18 只斑马鱼幼虫在受精后 72 小时，嵌入琼脂糖后 3 小时的明场平铺扫描。

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