文献解读：单细胞分辨率下破骨细胞形成过程
2023-03-29 来源:本站 点击次数:1772
导语
破骨细胞是唯一的骨质吸收细胞，该细胞在骨代谢中有核心作用，同时也和在病理条件触发的骨质损伤有关。在出生后，造血干细胞来源的前体升高并转化为破骨细胞，这种转化需要巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB配体受体激活剂（RANKL）的刺激下产生，而这两种因子都是由“破骨细胞生成支持细胞”分泌，如成骨细胞和骨细胞1-3。
然而，破骨细胞分化过程机制尚不明确。因此，本文研究了7228个小鼠细胞的转录组，结合体外实验分析破骨细胞的形成过程。基于单细胞转录组结果，本文发现破骨细胞前体细胞瞬时表达CD11c，并且在CD11c表达的细胞中敲除RANKL，会阻止这部分细胞进一步形成破骨细胞。同时本文证实反式激活子（Cited2）作为核心分子刺激破骨细胞的末端分化。破骨前体细胞Cited2缺失后会导致破骨细胞分化失败。总结：本文提供了破骨细胞分化过程详细的分子路线图，细化和扩大我们对潜在分子机制的理解。
科学技术
单细胞转录组测序；Bulk RNA-seq
实验思路
研究结果
1. scRNA-seq检测破骨细胞体外培养系统中的细胞异质性
小鼠骨髓细胞用先用M-CSF培养2d，这些细胞被进一步用M-CSF联合RANKL培养3d（图1a）。本文通过单细胞测序，分析质检通过的7,228个细胞。设计了第0天，第1天和第3天三个分组，分别对应2,190、2,649和2,389的细胞数。基于无监督聚类方法区分了12个cluster，涵盖以上三个分组（图1b）。cluster7只出现在第3天且高表达破骨细胞相关的标记基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Nfatc1，Dcstamp，Atp6v0d2）表明cluster7代表成熟的破骨细胞（图1b，c）。在相比之下，cluster 1在第0天大量存在，但是在第1天和第3天会消失。cluster 1显示破骨前体细胞的标志物（Tnfrsf11a,，Csf1r和Cx3cr1），同时还有破骨细胞形成的内在负调节因子（Irf8, Bcl6和Mafb；图1b，d，e），这些都提示cluster1中包含了破骨前体细胞。
2. 破骨细胞分化轨迹
下一步，本文通过Slingshot分析方法进行拟时序分析，该方法基于聚类的12个cluster预测它们的分化轨迹。分析结果表明cluster1经过cluster9，cluster3，cluster2和cluster4逐步转化cluster7（图2a）。在这转化过程中，破骨细胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表达水平逐渐升高，而骨破骨形成负调控因子(Irf8，Bcl6和Mafb)的表达水平逐渐下调（图2b），结果与bulk RNA-seq 数据一致。
接下来，我们使用Slingshot进行伪时间分析，该方法可以基于基于聚类的最小生成树12预测分化轨迹。伪时间分析表明，聚类1通过逐步分化为聚类7，并经过聚类9、3、2和4（图2a）。在这一过程中，破骨细胞基因（Acp5，Ctsk，Mmp9，Dcstamp，Ocstamp和Atp6v0d2）的表达水平逐渐升高，而与破骨形成负调控因子（Irf8，Bcl6和Mafb）的表达水平逐渐下调（图2b），该结果与bulk RNA-seq数据结果一致。Itgax（编码蛋白CD11c）为树突细胞（dendritic cell，DC）标记基因；而在破骨细胞发生的分化轨迹中，Itgax的表达短暂上调（图2c）。这也预示着破骨前体细胞表达特征和DC有相似地方。
有一些研究认为DC细胞就是破骨前体细胞；但也有相关研究发现小鼠即便有成熟DC细胞缺陷，也不会对破骨细胞的形成造成影响。为此构建基因工程鼠，特异性抑制DC细胞中Tnfrsf11a的表达（Tnfrsf11aflox/ΔCD11c-Cre），该小鼠和对照小鼠（Tnfrsf11aflox/Δ）相比，破骨细胞的形成明显受到抑制；与之相反骨组织的体积、骨小梁的厚度增加（图2d–h）。
为了进一步验证拟时序的结果，本文进一步探索了培养第1天的细胞表面的标志物（图2i）。结果显示C5aR1+CSF1R+细胞（cluster2和cluster3）和C5aR1−CSF1R+细胞（cluster4）转化为破骨细胞；而C5aR1−CSF1R−细胞（cluster6和cluster8）未能分化为破骨细胞，这表明cluster2、3和4代表了破骨前体细胞，但cluster6和cluster8不具备分化成破骨细胞的潜力（图2j）。这些结果进一步验证了破骨细胞分化轨迹，并明确破骨细胞体外培养中展现的细胞异质性（图2k）。
3. 破骨细胞形成过程中的逐步生物学过程
为了阐明破骨细胞发生的分步生物学过程，本文需cluster1、9、3、2、4和7进行了GO富集分析（图3）。cluster1代表第0天的破骨前体细胞，主要设计单核细胞转录组表达包括：髓系白细胞活化、髓系细胞分化、吞噬体和Fcγ受体依赖的吞噬细胞（图3）。cluster9代表DC样前体细胞，富集抗原处理和呈递相关（图3）。cluster3可能代表RANKL诱导的早期破骨前体细胞，其中包含了膜筏上产生含有RANK复合体和基于酪氨酸的免疫受体激活信号，这些功能促进破骨细胞信号转导（图3）。cluster2主要是破骨前体细胞增殖激活的代谢功能。cluster4主要涉及能量代谢和末端分化。cluster7主要呈现破骨细胞的特征，包括骨质吸收和内吞等功能。
4. Cited2作为触发破骨细胞末端分化的分子开关的鉴定
本文最后还研究了参与调控破骨细胞生成的转录因子。伴随破骨细胞形成的过程中有25个转录调控因子发生了显著的改变。其中Cited2可以调控一些破骨细胞形成的核心基因，如Nfatc1和Jdp2。Bulk RNA -seq结果显示，当敲除Cited表达，破骨前体细胞的细胞周期功能上调（图4b）。构建基因工程鼠，特异性敲除巨噬前体细胞的Cited的表达（Cited2flox/floxTnfrsf11a-Cre）。工程鼠中破骨细胞的形成明显受到抑制（图4c，d）。流式细胞仪分析破骨细胞培养体系的细胞，结果显示Cited2flox/floxTnfrsf11a-Cre在第一天可以产生CSF1R+C5aR1+细胞(即增殖的破骨前体细胞) ，但在第2天未能继续转化CSF1R+C5aR1−（图4e）。最终归纳破骨细胞分化图，可以看到细胞逐步改变的状态并伴随的调整的功能和通路，Cited2的作用位置，同时还列出每个cluster的高表达基因（图4f）。
参考文献：
sukasaki M, Huynh NC, Okamoto K, et al. Stepwise cell fate decision pathways during osteoclastogenesis at single-cell resolution. Nat Metab. 2020;2(12):1382-1390. doi:10.1038/s42255-020-00318-y