使用高分辨熔解曲线法（HRM）进行基因分型的原理和优缺点
2023-09-13 来源:酷搏科技 点击次数:4812
高分辨熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）分析是使用荧光定量PCR仪和双链DNA染料，在PCR扩增后通过实时检测升温过程中双链DNA解链的过程，对DNA片段进行检测。
HRM基本原理：
1、两种（或多种）基因型的qPCR引物序列相同，位于突变位点的上下游。
2、在包含饱和双链染料（如LC Green、EvaGreen等）的qPCR体系中加入引物与样本，在qPCR程序中扩增至接近饱和（一般30-40循环）后，进行熔解曲线分析（缓慢升温过程中连续记录样本荧光）。
3、通过与已知基因型样品比较熔解曲线的形状，确定未知样品的基因型。
HRM方法优点：
1、比荧光探针法体系简单。
2、比荧光探针法成本低。
3、可以提示存在其它未知类型的突变。
HRM方法缺点：
1、经典方法分辨A/T或C/G单碱基突变难度较大。
2、解链温度受Mg2+浓度和一些抑制剂影响较大，对样本纯化、加样准确度的要求稍高。
在酷搏科技Quantagene q225/q900荧光定量PCR仪上使用HRM进行基因分型的优势：
1、整板一次成像，避免在线性升温过程中扫描不同孔带来的温度差。
2、孔间温度一致性高，结果准确度高。
3、HRM软件模块功能强大，可用多种方式作图分析。
4、速度快，分辨率优于0.02°C/点的HRM程序仅需约20分钟完成，相当于其它品牌仪器的普通熔解曲线运行时间。
5、5-10μl体系，比常规方法节省50%-90%的试剂，大幅降低检测成本。
对于某位于人类1号染色体的50bp基因片段，分别使用第25位碱基为C的野生型基因及该位点突变为A,T,G或被删除的突变型基因为模板，使用相同引物及实验条件在q225荧光定量PCR仪上进行高分辨熔解曲线实验。图中所示为不同突变类型模板之间的归一化熔解曲线差值图。
其它说明：
1、HRM的引物设计一般需要符合qPCR的引物设计要求，且在满足包含突变位点的要求下扩增片段尽量短。
2、建议至少加入两种纯合、50%杂合的样本，以对未知样本进行比较。
3、包含SYBR Green的qPCR试剂也可以分辨一些突变，但分辨率一般没有LC Green或EvaGreen好。
4、可以通过包含在引物3’端包含突变位点的两对或多对引物设计，对不同基因型产生不同的PCR产物（如ARMS PCR或One-step ARMS qPCR）。此方法结合熔解曲线分析，可对SNP取得更好的区分效果。
HRM基本原理：
1、两种（或多种）基因型的qPCR引物序列相同，位于突变位点的上下游。
2、在包含饱和双链染料（如LC Green、EvaGreen等）的qPCR体系中加入引物与样本，在qPCR程序中扩增至接近饱和（一般30-40循环）后，进行熔解曲线分析（缓慢升温过程中连续记录样本荧光）。
3、通过与已知基因型样品比较熔解曲线的形状，确定未知样品的基因型。
HRM方法优点：
1、比荧光探针法体系简单。
2、比荧光探针法成本低。
3、可以提示存在其它未知类型的突变。
HRM方法缺点：
1、经典方法分辨A/T或C/G单碱基突变难度较大。
2、解链温度受Mg2+浓度和一些抑制剂影响较大，对样本纯化、加样准确度的要求稍高。
在酷搏科技Quantagene q225/q900荧光定量PCR仪上使用HRM进行基因分型的优势：
1、整板一次成像，避免在线性升温过程中扫描不同孔带来的温度差。
2、孔间温度一致性高，结果准确度高。
3、HRM软件模块功能强大，可用多种方式作图分析。
4、速度快，分辨率优于0.02°C/点的HRM程序仅需约20分钟完成，相当于其它品牌仪器的普通熔解曲线运行时间。
5、5-10μl体系，比常规方法节省50%-90%的试剂，大幅降低检测成本。
对于某位于人类1号染色体的50bp基因片段，分别使用第25位碱基为C的野生型基因及该位点突变为A,T,G或被删除的突变型基因为模板，使用相同引物及实验条件在q225荧光定量PCR仪上进行高分辨熔解曲线实验。图中所示为不同突变类型模板之间的归一化熔解曲线差值图。
其它说明：
1、HRM的引物设计一般需要符合qPCR的引物设计要求，且在满足包含突变位点的要求下扩增片段尽量短。
2、建议至少加入两种纯合、50%杂合的样本，以对未知样本进行比较。
3、包含SYBR Green的qPCR试剂也可以分辨一些突变，但分辨率一般没有LC Green或EvaGreen好。
4、可以通过包含在引物3’端包含突变位点的两对或多对引物设计，对不同基因型产生不同的PCR产物（如ARMS PCR或One-step ARMS qPCR）。此方法结合熔解曲线分析，可对SNP取得更好的区分效果。
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