细胞死亡的新途径泛凋亡 (PANopotosis)详述
2024-01-30 来源:本站 点击次数:1958
在所有提出的程序性细胞死亡 (PCD) 形式中，细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡是最明确的，其复杂的分子机制负责细胞死亡的启动、转导和执行[1]。但实际上这三种途径之间存在复杂的串扰。例如在无菌损伤和感染性疾病（例如甲型流感病毒 IAV 感染）中，研究人员观察到所有三种 PCD 途径的生化标记物均被激活[1]。
2019 年，美国学者 Malireddi 将这种具有焦亡、凋亡和坏死性凋亡特征的新型死亡方式命名为泛凋亡，并提出先天性免疫传感器 ZBP1 和 TAK1 激酶在泛凋亡小体复合物组装的调控中发挥重要作用[2]。
Tips：泛凋亡(PANoptosis) 是由特定触发器激活并 PANoptosome 复合物调节的炎症性 PCD 途径，其综合了细胞焦亡、细胞凋亡和/或坏死性凋亡的关键特征，这也是 PANoptosis 术语中 “P” “A” 和 “N” 的来源，但其不能被细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡中任意一种死亡方式单独表征[1]。
多种蛋白质可以形成调节 PCD 的多蛋白复合物，其基于各种蛋白质结构域之间的相互作用，可分为三类：传感结构域、组装结构域和催化结构域[2]。
▐ 泛凋亡小体: PANoptosome
泛凋亡受到上游感受器和分子信号的级联调控，这些传感器和级联信号组装成一种多聚体复合物，即泛凋亡小体 (PANoptosome)。PANoptosome 及其上游的感受器不仅是下游分子的激活平台，也是 3 种 PCD 途径的启动“总开关”[4][5]。
PANoptosome 小体作为一种分子支架，允许参与焦亡、细胞凋亡和/或坏死性凋亡的关键分子进行耦联和结合[1]。传感器蛋白在感知到病原体成分后，会介导 RIPK3、RIPK1、CASP8、FADD等蛋白组装成 PANoptosome 复合体，从而诱导 PANoptosis[2][6]。
构成 PANoptosome 小体的蛋白质通常可分为三类：(1) ZBP1 和 NLRP3 作为假定的 PAMP 和 DAMP 传感器，(2) ASC 和 FADD 作为适配器，以及 (3) RIPK1、RIPK3 、CASP1 和 CASP8 作为催化效应器[2]。
图 3. 泛凋亡小体及其通路[4]。
Tips：(1) ZBP1 泛凋亡小体：Z-DNA 结合蛋白 1 (ZBP1) 是一种先天免疫受体，被鉴定为甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）的感受器和 IAV 感染期间细胞死亡的主要调节因子。在 IAV 刺激下，ZBP1 作为特异的感受器被激活，进而触发 PANoptosome 的组装[7][8]。ZBP1-PANoptosis 形成后，可以启动由焦亡、凋亡和坏死性凋亡成分组成的泛凋亡，最终导致溶解性炎症细胞死亡，其特征是 Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8 的激活和 MLKL 的磷酸化[9]。
(2) RIPK1 泛凋亡小体：RIPK1 介导的泛凋亡小体主要由 RIPK1、ASC、Caspase-1、Caspase-8 和死亡相关结构域蛋白（fas-associated protein with death domain，FADD）构成，最早由 Malireddi 教授团队提出。该团队还发现 TAK1 可作为 RIPK1-PANoptosome 的调控主开关，因为 TAK1 基因的缺失或者功能失活可以触发 RIPK1-PANoptosome 的组装。然而，后续研究发现，TAK1 的缺乏同样可以诱导 RIPK1 非依赖的泛凋亡通路的激活，后者主要由 RIPK3-MLKL 介导。
(3) AIM2 泛凋亡小体：其组成分子包括 AIM2、ZBP1、pyrin、ASC、Caspase-1、Caspase-8、RIPK1、RIPK3 和 FADD[10]。AIM2 炎性小体可感知双链 DNA，AIM2 调节先天免疫传感器 Pyrin 和 ZBP1 来驱动炎症信号传导和炎症细胞泛凋亡，在人类的正常发育、传染性疾病、炎症和肿瘤方面发挥重要作用。
说了这么多，这种 “三合一” 的复杂细胞死亡方式，又该如何研究及检测的呢？
首先咱们来说检测，由于泛凋亡综合了细胞焦亡、细胞凋亡和/或坏死性凋亡的关键特征，因此在进行相关检测时三方面缺一不可！
之前小 M 也为大家整理过相关的检测方法，那么本期仅做整理，不再详述。
Tips：
泛凋亡检测方法及指标！
（1） 观察细胞形态：细胞焦亡引起细胞质肿胀和膜破裂；凋亡主要形态学特征包括染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。（2） 检测不同 PCD 的关键蛋白：焦亡相关：Caspase-1、Caspase-3、Gasdermins、AIM2/Pyrin/NLRP3 等；凋亡相关：Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、PARP、Bax/Bcl 等；坏死性凋亡相关：MLKL、RIPK1、RIPK3、ZBP1 等。
（3） 其他指标检测：Annexin V-FITC 和 PI 联合染色；TUNEL 法；JC-1 检测；ELISA 检测炎症因子的释放；免疫印迹、流式等技术检测炎性小体 NLRP3 的表达和 Caspase-1 的活化情况。
▐ 文献案例解读（IF=39.3）：
近期，Jin-Fei Lin 等人发现磷酸化的 NFS1 可通过预防 PANoptosis 以削弱结直肠癌的 Oxaliplatin 敏感性[11]。
作者使用基于体内代谢酶基因的 (CRISPR)-Cas9 文库筛选，发现 NFS1 的缺失显著增强了 CRC 细胞对奥沙利铂的敏感性。体外和体内结果表明，NFS1 缺陷与 Oxaliplatin 协同作用，通过增加细胞内活性氧 (ROS) 水平，引发泛凋亡。
图 4. 磷酸化的 NFS1 通过降低 ROS 水平来减弱铂基化学敏感性，从而防止 PANoptosis[11]。
为了研究发生的细胞死亡类型，使用常见细胞死亡途径的多种抑制剂并结合光镜观察细胞形态、YP1/PI 染色、流式检测细胞死亡等进行检测。结果表明，焦亡 (GSDME) 抑制剂 Disulfiram 和自噬抑制剂 3-methyladenine 无显著作用，而凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK 、坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1 、铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 、焦亡 (GSDME) 抑制剂 Ac-DMPD/DMLD-CMK 逆转（但不能完全恢复）Oxaliplatin 治疗下由 NFS1 缺乏引起的细胞活力降低和细胞毒性增强 (图 5)。
图 5. Oxaliplatin 联合多种抑制剂的细胞活力及毒性测定[11]。
a-b: 对照和 NFS1 敲低 HCT116 细胞的细胞活力 (a) 和细胞毒性 (b) 评估; c-d: 对照和 NFS1 敲低 DLD1 细胞活力 (c) 和细胞毒性 (d) 评估。
为了进一步证实 PANoptosis 的发生，作者发现 NFS1 敲低联合 Oxaliplatin 治疗显著增加了死亡细胞的数量，包括指示细胞凋亡或坏死性凋亡的 YP1 阳性细胞和指示细胞坏死性凋亡、细胞焦亡或铁死亡的 PI 阳性细胞 (图 6: 左图, a-b 和右图 a-b)。
对 HCT116 细胞的分析还表明，联合组中从质膜出现的大气泡数量明显高于阴性对照组、NFS1 敲低组和 Oxaliplatin 治疗组，这表明细胞焦亡的发生 (图 6: 左图, a)。此外，NFS1 耗竭后进行 Oxaliplatin 治疗定量增加了早期/晚期凋亡细胞的数量，并显著减少了活细胞的数量 (图 6: 左图, c-d 和右图 c-d)。此外，在 NFS1 敲低组和 Oxaliplatin 治疗组中检测到的脂质 ROS 含量高于对照组。这种增加在联合组中更为明显，表明铁死亡的发生 (图 6: 左图, e 和右图 e-f)。因此，这些数据表明 NFS1 缺陷与 Oxaliplatin 联合有助于 PANoptosis 的激活。
图 6. NFS1 缺陷与 Oxaliplatin 治疗协同作用，诱导 PANoptosis[11]。 (左图): a. 对照中可能发生凋亡或坏死性凋亡的 YP1+细胞（绿色）和可能发生凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡或铁死亡的 PI+细胞（红色）以及用 Oxaliplatin 处理的 NFS1 敲低 HCT116 细胞。底部显示为明场，红色箭头表示从质膜中出现的大气泡; b. 对 (a) 中的 YP1+ 和 PI+ 细胞进行定量。c-d: 流式细胞术 (c) 和采用膜联蛋白 V/PI 染色的定量分析 (d)，在对照和用 PBS 或 Oxaliplatin 处理的 NFS1 敲低 DLD1 细胞中评估活细胞 (Annexin V- /PI-)、早期凋亡细胞 (Annexin V+ /PI-) 和晚期凋亡细胞的百分比 (Annexin V+ /PI+); e. 通过 BODIPY™ 581/591 C11 探针测定评估用 Oxaliplatin 处理的对照和 NFS1 敲低 HCT116 细胞中的脂质 ROS 水平。
(右图): a. 对照中可能发生凋亡或坏死性凋亡的 YP1+细胞（绿色）和可能发生凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡或铁死亡的 PI+ 细胞（红色）以及用 Oxaliplatin 处理的 NFS1 敲低 DLD1 细胞。底部显示为明场; b. 对 (a) 中的 YP1+ 和 PI+ 细胞进行定量; c. 使用膜联蛋白 V/PI 染色进行流式细胞术分析，评估对照和用 PBS 或 Oxaliplatin 处理的和 NFS1 敲除 HCT116 中活细胞 (Annexin V-/PI-)、早期凋亡细胞 (Annexin V+/PI-) 和晚期凋亡细胞 (Annexin V+/PI+) 的百分比; d. (c)中活细胞 (Annexin V-/PI-)、早期凋亡细胞 (Annexin V+/PI-) 和晚期凋亡细胞 (Annexin V+/PI+) 的定量; e. 使用 BODIPYTM 581/591 C11 探针测定法评估Oxaliplati 处理的对照细胞和 NFS1 敲低 DLD1 细胞中的脂质 ROS; F. 本研究中用于 ROS/脂质 ROS 分析的策略。
此外，作者评估了 Oxaliplatin 治疗下 NFS1 缺陷诱导 PANoptosis 的具体机制。总之，Oxaliplatin 介导的氧化应激可增强 NFS1 的丝氨酸磷酸化水平，并且 NFS1 以 S293 磷酸化依赖性方式阻止 Oxaliplatin 治疗下 PANoptosis 的激活。
本期小 M 为大家介绍了细胞死亡的新姿势：泛凋亡 (PANopotosis)，一种炎症性细胞程序死亡途径。三种重要的泛凋亡小体 ZBP1-PANoptosomes、AIM2-PANoptosomes 和 RIPK1-PANoptosomes 在其中发挥重要的调节作用，此外，小 M 为大家介绍了泛凋亡的检测指标，并通过文献案例进一步详述。希望大家能够有所收获喔~
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Oxaliplatin 是一种 DNA 合成 抑制剂。Oxaliplatin 会导致 DNA 交联损伤，阻止 DNA 复制和转录并导致细胞死亡。Oxaliplatin 以时间依赖方式抑制人黑色素瘤细胞系 C32 和 G361，IC50 值分别为 0.98 μM 和 0.14 μM。Oxaliplatin 可以诱导细胞自噬 (autophagy)。 |
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Disulfiram (Tetraethylthiuram disulfide) 是特异性的 ALDH1 抑制剂，对酒精具有急性敏感性。Disulfiram 有效抑制人体和小鼠细胞中脂质体中的 GSDMD 孔形成，炎性体介导的细胞凋亡和 IL-1β 分泌。Disulfiram + Cu2+ 可增加细胞内 ROS 水平，引发卵巢癌干细胞凋亡。 |
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Daurisoline 是一个 hERG 抑制剂，也是一种自噬抑制剂。 |
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Z-VAD-FMK (Z-VAD(OH)-FMK) 是一种 pan caspase 抑制剂。Z-VAD-FMK 不抑制泛素 C 末端水解酶 L1 (UCHL1) 活性，即使浓度高达 440 μM。 |
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Necrostatin-1 (Nec-1) 是一种有效的能透过血脑屏障的坏死性凋亡 (necroptosis) 抑制剂，在 Jurkat 细胞中的 EC50 为 490 nM。Necrostatin-1 抑制 RIP1 激酶 (EC50=182 nM) 。Necrostatin-1 (Nec-1) 也是一种 (IDO) 抑制剂。 |
参考文献：
[1] Wang Y, et al. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Struct Biotechnol J. 2021 Aug 3;19:4641-4657.
[2] Malireddi RKS, et al. ZBP1 and TAK1: Master Regulators of NLRP3 Inflammasome/Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis (PAN-optosis). Front Cell Infect Microbiol. 2019 Nov 26;9:406.
[3] Zhu P, et al. Advances in mechanism and regulation of PANoptosis: Prospects in disease treatment. Front Immunol. 2023 Feb 9;14:1120034.
[4] Pengyue Zhao, et al. Research progress on the role of PANoptosis in human diseases. August 2022Zhonghua Yi Xue Za Zhi 102(32):2549-2554.
[5] Christgen S, et al. Identification of the PANoptosome: A Molecular Platform Triggering Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis (PANoptosis). Front Cell Infect Microbiol. 2020 May 29;10:237.
[6] Samir P, et al. The PANoptosome: A Deadly Protein Complex Driving Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis (PANoptosis). Front Cell Infect Microbiol. 2020 Jun 3;10:238.
[7] Gullett JM, et al. It's All in the PAN: Crosstalk, Plasticity, Redundancies, Switches, and Interconnectedness Encompassed by PANoptosis Underlying the Totality of Cell Death-Associated Biological Effects. Cells. 2022 Apr 29;11(9):1495.
[8] Zheng M, et al. Newly Identified Function of Caspase-6 in ZBP1-mediated Innate Immune Responses, NLRP3 Inflammasome Activation, PANoptosis, and Host Defense. J Cell Immunol. 2020;2(6):341-347.
[9] Zheng M, et al. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunol Rev. 2020 Sep;297(1):26-38.
[10] Lee S, et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 2021 Sep;597(7876):415-419.
[11] Lin JF, et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduct Target Ther. 2022 Feb 28;7(1):54.