炎症性肠病早期诊断和预后评估的可激活NIR-II半花菁染料分子工程技术

2024-04-25 来源:恒光智影点击次数:1348

本文要点：作者合成了一系列半花菁支架（HBCs），其发射波长为715至1188 nm，具有可调谐的荧光结构，可用于构建可激活的探针。将苯并[c,d]吲哚等分子整合到传统的半氰基骨架中，以扩展线性π共轭并增强ICT效应（图2a）。在1088 nm处具有峰值发射的代表性探针HBC4在组织穿透深度方面优于HC1。HBC4能够清楚地辨别活体小鼠的肠道，而后者无法实现。还进一步构建了一种可激活的炎症探针（AIR-PE），用于pH触发的结肠特异性释放（图1）。口服 AIR-PE 可通过实时近红外成像，在炎症性肠病（IBD）小鼠模型中清晰地划分受刺激的肠道并评估治疗反应。由于AIR-PE的粪便清除率高（大于90%），它还可以通过体外光学粪便分析检测 IBD 和评估结肠炎的治疗效果，其效果优于粪便潜血检测和组织学检查等典型的临床检测方法。

图1. 用于炎症性肠病早期诊断和预后评估的实时NIRF-II成像和无创粪便分析的方法设计

首先，作者测量了HBC1−5的物理化学性质，并与HC1的物理化学性质进行了比较（图2d，e）。此外还进行了密度泛函理论（DFT）计算，HBC1−HBC5显示出LUMO逐渐降低以及HOMO增加（图2b），使能隙分别从2.77、2.67、2.38和2.34减小到2.00 eV（图2c）。结果表明，HBC2-HBC5在PBS中具有高的光稳定性，在连续激光照射30分钟下具有可忽略的荧光衰减（图2f）。HBC4和HBC5具有明亮的NIRF-II信号，而HBC1−3和ICG显示出相对较弱的信号。最后作者选择HBC4用于进一步成像应用的NIR-II荧光团，因为它相对于HBC5更易于合成。

图2. NIR-II半花菁荧光团性质分析

然后，作者在体外和体内检查了HC1和HBC4的穿透深度和成像灵敏度，获得了其组织渗透研究示意图（图3a）。在NIRF-I波长窗口中观察到较浅的穿透深度（<2 mm）（图3b）。 HBC4的信号背景比（SBR）均高出HC1的多倍（图3c）。上述结果表明具有稳定的NIR-II荧光信号的HBC4更适于体内深部组织成像应用。为比较HC1和HBC4的成像灵敏度，在口服或静脉内注射HC1或HBC4后，采集活体小鼠的全身荧光成像的荧光信号（图3d）。在PBS处理的小鼠、接受口服HC1-PE的小鼠和接受静脉注射HC1的小鼠中在腹部观察到相同的NIRF-I信号（图3e）。然而，在口服HBC4-PE或静脉注射HBC4后，在腹部观察到强烈的NIRF-II信号，但在PBS处理的小鼠中未出现（图3e）。因此，HBC4在活体小鼠肠道成像方面远远优于HC1。此外，与体内成像结果一致，仅在HBC4注射小鼠的粪便中检测到NIRF-II信号（图3 h）。然而，在NIR-I下HC1注射的小鼠和PBS注射的小鼠之间没有观察到显著差异（图3f），因此，HBC4在体外光学检粪方面优于HC1。在肠道成像方面，口服HBC4-PE优于静脉注射 HBC4。粪便样本的NIRF-II成像也观察到了一致的结果（图3f，h）。

图3. 组织穿透和成像灵敏度

此外，作者合成了一种可激活的探针（AIR），它包含三个关键的功能部分，如图1b所示。图4a展示了AIR的合成过程。然后，作者将AIR或AIR-C包封到PLGA和Eudragit S100中以分别合成AIR-PE或AIR-C-PE，用于在结肠pH下控制释放AIR或AIR-C（图1b）。为了研究探针释放特性，在PBS缓冲液中不同pH条件下进行AIR-PE的透析（图4f），其分别模拟胃、小肠和结肠区域的pH环境。此外，AIR-PE的NIRF-II强度在pH为2-10内不受影响（图4g），AIR-OH的NIRF-II强度在pH 6至11内保持稳定，表明其优异的pH稳定性。（图4 h）。

为了研究AIRPE的光学性质和传感能力，记录了其吸收和发射光谱。AIR-PE在765 nm处显示出最大吸收（图4 b，c），观察到1088 nm处的荧光信号与ClO⁻浓度之间具有良好的线性关系，（图4 e）。因此，AIR-PE在检测ClO⁻方面具有高灵敏度和特异性。为了验证AIR-PE在炎症诱导的活细胞中的ClO⁻检测能力，将RAW 264.7细胞接种到96孔板中，并用PBS或酵母聚糖（ZMS）培养。将细胞与AIR-PE或罗丹明B（Rho）一起孵育。使用小动物成像系统捕获细胞的荧光图像。结果证实（图4k-m），在细胞中AIR-PE的NIRF-II信号可以被ClO⁻激活。图4j显示灌胃后5天，AIR-PE的粪便清除效率与肾排泄效率。

图4. AIR-PE的设计、合成和表征

其次，为了评估AIR-PE用于IBD的实时成像和粪便分析的能力，使用毒性剂量的DSS（葡聚糖硫酸钠）（水中4%）通过口服诱导结肠炎，对照组小鼠用PBS处理。在不同时间点（0、3、6天）给小鼠口服AIR-PE或对照探针AIR-C-PE，随后进行NIRF-II成像（图5c）。在整个成像过程中，NIRF-II成像未能描绘对照小鼠的肠道。然而，在DSS治疗后3天，在AIR-PE灌胃后3小时，肠道可被清楚地描绘出来，在AIR-PE灌胃后6小时达到最大值（图5c-e）。在DSS治疗后3天观察到NIRF-II增强，且在第6天继续增强（图5 f，g）。

图5. IBD的实时NIRF-II成像和粪便分析

最后，作者进一步评估了其评价结肠炎治疗有效性的实用性。为了减轻溃疡性结肠炎，DSS处理的小鼠分别接受代表性药物的给药（图6a、b），PBS处理组作为对照。在治疗后，将AIR-PE口服给药于活小鼠。注射后12 h进行NIRF-II成像和粪便分析，并定量分析肠部位和粪便的信号。（图6c-f）。结果表明，与其他组相比，BR诱导了对溃疡性结肠炎的治疗效果。与PBS对照相比，结肠炎治疗抑制了粪便潜血，所有药物治疗组小鼠体重减轻和结肠长度缩短均有所缓解（图6 g）。此外，接受MTZ、5ASA、HC及BR的小鼠结肠中的TNF-α和IL-1β水平显著低于PBS治疗组（图6 g），表明结肠炎治疗可减少炎症发作。为了评估所有测试测定的灵敏度和特异性，进行了受试者工作特性（ROC）分析（图6 j），结果表明基于AIR-PE的NIRF-II成像和粪便分析具有高度区分性。

图6. 实时NIRF-II成像和粪便分析用于IBD的预后评估

本文报道了一系列具有记录长波长发射的荧光半菁（HBC）骨架可以避免肠道中食糜和排泄物的高自发荧光以及 NIRF-I 窗口中的低效成像能力，用于通过 NIRF-II 成像早期诊断和监测 IBD 的预后。为早期检测炎症病变和监测治疗反应提供了一种无创且更方便的方法，其性能优于 FOBT 和组织学检查等典型的临床/临床前检测。本文的工作不仅提出了第一个适用于深层病理事件的可激活 NIRF-II 成像的半菁骨架家族，而且还强调了开发超灵敏 NIR-II 荧光体外测定的必要性，用于临床前和临床环境中各种疾病的早期诊断和管理。

参考文献

Liu Y, Diao S, Ruan B, Zhou Y, Yu M, Dong G, Xu W, Ning L, Zhou W, Jiang Y, Xie C, Fan Q, Huang J. Molecular Engineering of Activatable NIR-II Hemicyanine Reporters for Early Diagnosis and Prognostic Assessment of Inflammatory Bowel Disease. ACS Nano 2024, 18, 11, 8437–8451

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