本文要点：聚合物胶束（PMs）的体内稳定性一直是研究者们长期争论的焦点。本研究通过直接分析生物样本中完整的胶束纳米载体，重新审视了这一关键问题。本文建立了一种密度梯度超速离心（DGUC）方法，直接从生物组织中分离出完整的聚合物胶束，并采用了聚集诱导猝灭（ACQ）探针进行近红外二区（NIR-II）成像，从而实现了对胶束完整性的实时监测和精确定量。结果表明，mPEG₂ₖ-PLA₂ₖ聚合物胶束在循环中保持结构稳定性超过16小时。更重要的是，脂蛋白，特别是低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），被鉴定为通过捕获共聚物而破坏聚合物胶束稳定性的主要血清成分，而白蛋白的影响则微乎其微。这种相互作用通过琼脂糖凝胶电泳和表面等离子体共振得到了验证，揭示了脂蛋白与聚合物胶束之间存在纳摩尔级的亲和力结合。系统循环过程中聚合物胶束密度的随时间增加表明胶束结构内存在内源性成分交换。结合密度梯度超速离心分离与基于聚集诱导猝灭的追踪技术的综合方法，为聚合物胶束纳米载体的体内命运提供了前所未有的见解，解释了其在循环中的延长存在，同时阐明了脂蛋白驱动的聚合物胶束结构稳定和随后解聚的机制。这些发现解决了先前在聚合物胶束稳定性评估中的差异，并为胶束药物递送系统的临床转化提供了关键的实验支持。

PMs作为药物递送载体因尺寸小、循环时间长、易制备和功能化而备受关注，但临床转化率低，主要因对其体内机制了解不足。静脉注射后，PMs面临稀释、高剪切力及与内源性成分相互作用等挑战，引发对其结构稳定性的质疑。监测胶束完整性对理解药物释放机制和载体功能至关重要。早期研究使用放射性标记发现胶束在低于CMC时仍有较长血液循环时间，但后续基于Förster共振能量转移（FRET）的荧光标记研究结果不一致，凸显了评估的不确定性。FRET方法存在信号衰减、再照明干扰和定量挑战等问题，本研究采用ACQ探针，通过荧光强度与颗粒质量的正相关关系精确追踪PMs结合动力学，提供了更优越的识别和定量完整PMs的能力。此外，从生物介质中回收胶束具挑战性，本研究采用密度梯度超速离心法从血清中回收胶束，并提出了综合方法，包括使用NIR-II ACQ荧光团标记、实时体内稳定性评估、回收PMs以直接观察完整性及分析组分与PMs相互作用。结果表明，模拟Genexol-PM®的mPEG-PLA PMs保持了结构完整性，体内循环超16小时，并逐渐通过与脂蛋白（尤其是LDL）相互作用解聚，为PMs作为纳米载体的实用性提供了实验支持。

图1. 基于ACQ标记的密度梯度超速离心（DGUC）法从血清中回收mPEG2k-PLA2k微粒（PMs）

图1A展示了基于吖啶橙（ACQ）的荧光标记原理，用于监测颗粒膜（PM）的完整性。当ACQ荧光团（ACQ1）被包裹在完整PM的疏水核心中时，其荧光被激活。PM解离后，释放的探针分散到水环境中，在疏水相互作用驱动下迅速聚集，导致荧光立即且完全猝灭。这一机制建立了荧光信号与完整PM存在之间的正相关性，从而能够识别和定量PM。水敏感性曲线（图1B）显示，当水含量超过40%时，ACQ1荧光在DMSO/水二元体系中完全猝灭，证实了其易受水环境影响的特点。图1C展示了ACQ1在测定mPEG₂ₖ-PLA₂ₖ的临界胶束浓度（CMC）中的成功应用，证实了其报告PM完整性的能力。之前的研究已验证了这种使用ACQ标记评估PM完整性的方法。

DGUC是一种成熟的方法，用于分离血清脂蛋白。图1D展示了HDL、LDL和VLDL的成功分离，在用苏丹黑（一种选择性结合脂蛋白亲脂域的染料）染色后，它们表现为三条清晰的黑色带。该DGUC方案应用于与血清孵育的PMs，以分散在PBS中的PMs作为对照。图1E（左）显示，DGUC有效地将纯PMs（PBS分散液）浓缩成位于LDL和HDL层之间的单个清晰蓝色带。荧光成像证实了代表完整PMs的信号与该蓝色带的共定位。梯度中其他位置没有可辨认的蓝色，表明探针泄漏可忽略不计，并间接验证了PMs在超离心力下的完整性。进一步的定量结果显示，从PBS中回收PMs的效率为92.5±1.5%，表明DGUC工作流程对PMs的完整性和回收率影响极小。

令人鼓舞的是，当对PM-血清孵育物进行DGUC时，完整的PM被成功分离，在与PBS分散的PM对照相同的位置出现一条蓝色条带（图1E，右）。为了确认回收的荧光信号仅来源于完整的PM，而非内源性血清成分，对从DGUC中回收的“PM”组分进行了基于PEG的免疫沉淀。该方法利用抗PEG抗体结合PM表面的PEG链和蛋白G琼脂糖的能力，通过低速离心形成复合物并沉淀。通过依次与抗PEG抗体和蛋白G琼脂糖孵育，从PBS分散中回收的PM被完全沉淀（图S2A）。为了防止血清样本中内源性免疫球蛋白的竞争性结合，首先将抗PEG抗体与蛋白G琼脂糖交联（图1F）。图1G和1H显示，从PM-血清孵育物中回收的“PM”中，>98%的荧光信号被沉淀，表明非PM相关的荧光信号可忽略不计。这些免疫沉淀结果为DGUC分离和鉴定PM的准确性提供了强有力的间接验证。最后，为了排除DGUC后荧光恢复是由ACQ1探针再发光（去猝灭）而非完整PM存在引起的可能性，评估了DGUC后ACQ1的猝灭状态。基于之前的发现，即新合成的NIR-II探针在血清或体循环中孵育24小时后表现出极低的再发光，研究者进一步使用DGUC方法证实了这一低再发光特性。图1I显示，DGUC后，PBS中预猝灭的ACQ1浓缩成单层（蓝色条带），管内其他位置未检测到荧光。此外，研究者还量化了不同浓度下血清中预猝灭ACQ探针的再发光情况。如图1J所示，在相同探针浓度下，LDL层中的再发光信号不到颗粒膜（PM）层中的5%。

图2. PMs体外稳定性研究

已建立的DGUC方法用于体外分析聚合物微粒（PMs）的稳定性。图2A显示了通过IVIS观察到的不同荧光带，证实了与血清孵育不同时间（5分钟、1小时、4小时、8小时）后完整PMs的存在。荧光信号随时间逐渐减弱，表明原始PMs发生了渐进性改变，这可能是由于胶束解聚或与血清成分的相互作用。有趣的是，随着时间的推移，低密度脂蛋白（LDL）层内出现了一个新的荧光带，且随着孵育时间的延长而增强（图2A和2B）。与图1J中显示的相应信号相比，该荧光带的强度明显更强。可以排除内源性成分干扰作为来源。相反，在LDL-PM相互作用过程中，探针转移是一个更合理的解释。鉴于LDL的颗粒结构具有高度疏水的核心，通过PM-LDL融合或交换介导的直接探针转移是高度可行的。或者，表面活性剂PM聚合物可能掺入LDL中，形成携带荧光探针的新复合物。理论上，血细胞膜等两亲性生物组分也可能诱导荧光转移。然而，之前在PM注射后的体内追踪显示荧光转移极少，这表明它们在此过程中作用不大。在没有直接PEG定量技术的情况下，观察到的现象暂时归因于PM聚合物向LDL的交换。然而，要证实这一假设，需要建立一种可靠的PEG定量方法。在此假设吸收复合物（ACQ）同时指示了PM解离和PM-生物相互作用。回收的PMs的粒度分析显示，其直径约为20纳米，与PBS对照组相当（图2C）。这些峰值信号始终高于“血清空白”的信号，后者是通过相同方法分离用作对照的。这表明血清孵育并未显著改变PM的基本结构。

由于对聚合物-脂蛋白相互作用的理解有限，胶束的完整性在特定范围内表达。保守估计，称为Cmin，代表通过DGUC分离的PM带荧光定量得到的完整PM的最小估计值。相反，上限估计，称为Cmax，通过结合PM带和“非PM”带（与PM结构相似的结构）荧光，从总血清荧光变化中得出完整PM的最大估计值。这一范围表达考虑了相互作用过程中物质转移确切性质目前的不确定性。基于校准曲线（图2D），通过在不同介质中建立颗粒结合荧光强度与颗粒浓度（以构成聚合物浓度表示）之间的线性关系，实现了半定量分析。根据校准曲线，聚合物浓度的检测限（LOQ）确定为0.5 mg/mL。近红外二区（NIR-II）成像证实，基质效应对该值的影响可忽略不计。检测限（LOD）为0.25 mg/mL，荧光信号比背景高5倍。该方法具有稳健性，具有良好的回归准确性和重复性。计算血清中PM的稳定性，结果如图2E所示。仅血清稀释不会自发损害PM的稳定性，最初保持>97%的完整性。然而，PM随时间逐渐分解，1小时时保持>90%的完整性，8小时后保持65%-90%的完整性。总体而言，尽管血清成分导致缓慢降解，但PM在较长时间内保持结构完整性。新荧光信号在低密度脂蛋白（LDL）层内的共定位表明脂蛋白是PM稳定性的主要调节剂。本研究证实了脂蛋白与PM之间的特异性相互作用，导致复合物保持原始PM荧光。然而，这些相互作用在多大程度上从根本上损害了PM本身的结构稳定性，尚需进一步研究。研究者推测，更高的负载可能会导致更多的探针猝灭或探针转移到LDL，但PM的稳定性不会低于基于该最大负载计算的结果。

图3. PMs体内稳定性研究

利用近红外二区（NIR-II）成像技术的优势，直接在原位观察了完整颗粒物质（PMs）在血管和器官内的分布情况。选择小鼠是因为其皮肤层较薄，更有利于在线血管可视化。与完整颗粒物质相对应的荧光信号在血流中循环了较长时间（图3A）。随着血管荧光的逐渐减弱，肝脏荧光强度逐渐增加，表明颗粒物质在肝脏中积累。基于NIR-II的体内成像技术的高分辨率使得原位血管荧光与离体血液荧光测量之间呈现出强烈的线性相关性。

即使在长时间循环后，仍能从血清中成功回收代表完整PMs的荧光带（图3B）。粒径分析（图3C）显示，注射后8小时，有一部分颗粒膜保持了其原始粒径（约20纳米），尽管有少数颗粒的粒径超过了1000纳米。与采用相同方法处理的“空白血清”相比，颗粒膜在全身循环后出现了一个新的峰（>1000纳米），认为这是由于PMs发生了聚集。有趣的是，与体外血清孵育后回收的颗粒膜不同，体内分离的PMs在全身循环过程中表现出向更高密度的轻微偏移（图3D）。推测这种密度变化是由于聚合物浓度降低，同时蛋白质更多地插入到胶束结构中，形成了混合胶束复合物，这些复合物在保持粒径的同时改变了密度。

虽然简单的血清稀释对PM的稳定性影响甚微，但同时暴露于高剪切力下可能会加剧颗粒的破坏。比较静态（体外，图2B）与动态（体内，图3D）条件下的荧光分布特征表明，剪切力会略微加速PM的劣化。要进一步验证假设，需要使用微流控或受控剪切力孵育系统等方法。事实上，先前的研究已证明，在体外模拟装置中，血液剪切力、与血细胞的碰撞以及与毛细血管壁的冲击都会加速PM的破坏。如前所述，PM的完整性在特定范围内表达。图3E显示，在全身循环1小时和4小时后，分别有79%-93%和54%-75%的PM保持结构完整性。值得注意的是，这一稳定性超过了报道值，在等效聚合物剂量下，1小时后仅约25%的完整颗粒残留。与其长期循环特性一致，即使在16小时后，仍有12%-35%的完整PM存在于血液中（图3E）。必须强调的是，该方法的局限性在于，所测量的循环中完整PM的减少代表了它们从血流中物理清除和结构解体的综合效应。本文的方法对总剩余完整PM进行了半定量分析，但未区分这两个过程的各自贡献。未对PM的稳定性进行剂量依赖性评估。此外，由于基于吸收对比（ACQ）的成像是在1300 nm以上进行的，因此使用较低的聚合物浓度可能会显著降低信噪比，从而可能影响半定量结果的准确性。

图4. 通过琼脂糖凝胶电泳（GEL）方法验证PM的完整性

为了验证分离过程本身对PMs稳定性没有显著影响，研究者采用了琼脂糖凝胶电泳法理论上，带负电荷的蛋白质在电泳过程中会向阳极迁移，而中性颗粒物质则大部分保留在加样孔中，或因电渗作用而表现出轻微的阴极漂移（图4A）。苏丹黑染色证实了高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）蛋白质在凝胶上的迁移（图4B），且颗粒物质在电泳缓冲液中表现出稳定性。通过建立总保留荧光强度与聚合物浓度之间的线性关系，实现了加样孔中颗粒物质的半定量分析（图4C）。在三个选定时间点，与血清体外孵育的颗粒物质计算出的稳定性值在凝胶电泳法和DGUC法之间没有显著差异（图4D）。同样，通过凝胶电泳法获得的体内颗粒稳定性结果在不同循环时间下与DGUC数据一致（图4E）。这些在不同分离技术下的一致发现强烈表明，本文的分离方法对颗粒物质稳定性影响微乎其微。因此，凝胶电泳法为血清样本中颗粒物质的回收和评估提供了一种便捷的替代方法。

图5. 从血清中回收的PMs的形态学表征

使用透射电子显微镜（TEM）检查了从孵育混合物和血液样本中回收的PMs的形态。本研究通过在1小时和4小时孵育后对血清孵育物进行密度梯度超离心（DGUC）以及在注射后1小时和4小时收集的血清样本，成功地从生物样本中分离出颗粒物质，以空白血清和PBS处理的颗粒物质作为对照，通过TEM对回收的颗粒物质进行直接形态学观察。

收集的PM层通过分子排阻色谱法，使用G15葡聚糖凝胶柱进行脱盐处理（图5A）。对包括超滤和透析在内的脱盐方法进行比较评估，证实分子排阻色谱法能够很好地保持颗粒物质的完整性。回收颗粒物质的形态和粒度分布特征如图5B所示。为评估处理效果，将PBS分散的颗粒物质进行了相同的操作程序。这些对照颗粒物质尽管名义粒度增加了约30 nm，但保持了均匀的粒度分布，实际变化保持在10 nm以下，多分散指数（PDI）从0.21略微增加到0.35。透射电子显微镜（TEM）观察结果的验证包括计数100个颗粒并绘制粒度分布图，以区分颗粒物质与内源性血清成分（图5B和C）。对照空白血清显示宽泛的粒度分布，在20至60 nm之间没有明显的峰值。血清回收颗粒物质与PBS回收颗粒物质的粒度分布高度一致，证实图4B中的大多数颗粒为颗粒物质而非内源性成分。TEM分析进一步表明，生物样本回收的颗粒物质保持了其球形形态，粒度没有显著变化。

图6. 脂蛋白通过在动态平衡中捕获聚合物，缓慢破坏PM结构

在与包括人血清白蛋白（HSA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、脂蛋白（Lipo，HDL和LDL的混合物）、脂蛋白缺乏血清（-Lipo）和载脂蛋白（Apo）在内的多种蛋白质进行4小时体外孵育后，评估了PMs的稳定性。由于极低密度脂蛋白和胆固醇脂质微粒在脱盐透析步骤中不稳定且易沉淀，因此未将其纳入考虑范围。除HSA外，所有蛋白质均从大鼠血清中提取。琼脂糖电泳将颗粒物质与蛋白质混合物分离，从而能够计算各组分对颗粒稳定性的特定影响（图6A，左）。HSA和-Lipo在共孵育后未表现出结构影响，超过90%的颗粒保持完整。脂蛋白诱导的不稳定性反映了全血清的影响，凝胶孔中约有75%的颗粒保持完整。虽然单独的HDL不会引起不稳定，单独的LDL仅引起15%的结构损伤，但脂蛋白中两种成分的共同存在可能产生了协同破坏作用。单独的载脂蛋白未表现出稳定性影响，这表明脂蛋白中的脂质成分是关键的相互作用因素。这些发现通过动态凝胶渗透色谱（DGUC）（图6A，右）得到了进一步验证，尽管该方法复杂且时间有限，但DGUC证实了脂蛋白特异性引起的稳定性衰减趋势是一致的。

脂蛋白和PMs均表现出具有磷脂和载脂蛋白的颗粒结构，这些磷脂和载脂蛋白具有与共聚物相似的两亲性特征。脂蛋白衍生的脂质可能会破坏共聚物链，而两亲性共聚物则可能相互掺入到结构兼容的脂蛋白中。由于生物组分检测的限制，直接评估聚合物在血清蛋白中的分布具有挑战性。荧光标记策略可能会改变结合亲和力，因此采用无标记表面等离子体共振（SPR）检测来评估聚合物-蛋白质相互作用。该方法将血清中含量最丰富的蛋白质固定在传感器芯片上，然后进行受控的聚合物引入和分离监测（图6B）。将不同聚合物浓度的PMs加载到传感器表面进行结合分析，随后通过缓冲液洗涤进行解离。不同蛋白质的结合曲线如图6C所示。HSA与PMs的结合未显示出明显的结合信号，表明结合和分离动力学迅速。响应信号在缓冲液洗脱后完全恢复到基线水平。相比之下，两种脂蛋白均表现出明显的结合趋势，其特征是结合和分离缓慢。此外，缓冲液洗涤未能完全洗脱结合的分析物，由于聚合物与芯片之间的非特异性结合，留下了残留信号。图6D展示了通过亲和力分析得出的平衡解离常数（KD）。HDL和LDL的KD值与HSA相比相差一个数量级以上。具体而言，HSA的KD值在低微摩尔范围内（10−4–10−6 M），而两种脂蛋白均表现出纳摩尔级的亲和力（10−7–10−9 M），表明它们与聚合物的相互作用更强。尽管已知HDL比LDL组装得更紧密，对PMs的破坏作用较小，但在SPR实验中观察到的相似KD表明，芯片固定的HDL可能发生结构改变，导致组装更松散，从而模拟LDL的结合行为。

这种亲和力趋势与上一节中的结构发现相一致：脂蛋白部分破坏了PM结构，而白蛋白尽管在血清中含量丰富，但对膜磷脂稳定性影响甚微。脂蛋白的高亲和力和稳定结合可能使其能够在动态平衡中螯合聚合物。这支持了本文的假设，即材料转移导致了在低密度脂蛋白（LDL）层中观察到的新荧光带。
  
总之，本文成功建立了一种DGUC方法，用于从生物样本中分离和回收PMs，显著提升了研究者对它们在体外和体内稳定性的理解。该方法通过基于琼脂糖凝胶电泳（其基于不同的分离原理）相互验证了其可靠性。在近红外二区（NIR-II）利用基于吖啶橙（ACQ）的成像技术，能够直接观察并更精确地量化颗粒的完整性。研究结果表明，PMs在血清和全身循环中长时间保持稳定的颗粒状结构。它们可能通过聚合物被提取到脂蛋白的脂质核心中而逐渐被脂蛋白破坏。完整的PMs可以在血液中循环至少16小时，其中12%至35%的结构保持完整。脂蛋白，特别是低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），被确定为影响颗粒结构的唯一成分。研究者提出，由于聚合物与脂蛋白的高结合亲和力，当聚合物被提取到脂蛋白脂质结构中时，PMs结构的动态平衡可能会逐渐被破坏。然而，仍需借助强大的检测工具来验证聚合物在不同蛋白质中的分布情况。研究还揭示了PMs在全身循环过程中密度的时变特征，这表明它们可能与胶束结构内的内源性成分发生交换过程。未来工作的目标是阐明在蛋白质相互作用过程中，剩余聚合物微粒的结构转变。此外，本研究为探究载药PMs的稳定性和释放动力学建立了基础框架。关键的下一步是评估药物包封对PMs稳定性和生物相互作用的影响。本文确定的脂蛋白驱动的解聚机制为体内药物释放提供了一种合理的解释。因此，脂蛋白与载药PMs系统（如Genexol-PM®）的释放特性之间的关系值得进一步深入研究。

参考文献

Zhang, Zichen, et al. "In vivo stability of polymeric micelles revealed by analysis of intact nanocarriers." Journal of Controlled Release (2025): 114384.

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