理解大脑如何工作，需要我们能够窥视其内部密集的神经元网络，观察它们是如何被激活并相互“交流”的。在活体大脑中，同时、快速、清晰地对成千上万个神经元的活动进行成像，是神经科学领域长期追求的目标。近日，一项发表于顶级期刊的研究介绍了一种名为FACED 2.0的革命性成像技术，它犹如为观察大脑内部世界安装了一台“超高速、超高清摄像机”，首次实现了在活体动物中同时对数百个神经元的电压信号和上万个神经元的钙信号进行大规模记录，将神经活动成像的尺度、速度和分辨率推向了前所未有的新高度。

这项突破性研究由Jian Zhong、Ryan G. Natan、Qinrong Zhang、Justin S. J. Wong、Christoph Miehl、Krishnashish Bose、Xiaoyu Lu、Francois St-Pierre、Su Guo、Brent Doiron、Kevin K. Tsia和Na Ji共同完成。他们的研究成果以题为“FACED 2.0 enables large-scale voltage and calcium imaging in vivo”的论文形式在线发表在《自然-方法》（Nature Methods）期刊上。

重要发现
01重新定义高速成像的边界
本论文的核心在于对FACED（自由空间角度啁啾增强延迟）成像技术进行了全面升级，推出了FACED 2.0系统。传统双光子荧光显微镜的成像速度受限于机械式扫描镜的惯性，其线扫描率通常仅为每秒数万次，导致成像帧率有限。FACED技术的精髓在于，它采用了一种全光学的、被动的扫描模块，通过一对近乎平行的反射镜将单个激光脉冲“复制”成在空间上分离、时间上延迟的一系列焦点阵列。这个阵列本身就构成了一次线扫描，其扫描速率直接等于激光的重复频率，可轻松达到兆赫级别，是传统方法的数十倍。

FACED 2.0在此基础上，通过硬件和软件的协同优化，实现了在超大视野和三维体积内，以亚细胞分辨率进行连续、超快的成像。其像素率高达每秒10亿像素，同时保持了与传统方法相媲美的空间分辨率和成像深度。

为了获得二维图像，系统使用一个标准的振镜扫描镜沿垂直于这条“光针”线的方向进行慢速扫描，从而完成逐行扫描。为了进一步扩大成像视野，FACED 2.0引入了第二个振镜，用于横向拼接多个高速的FACED视野。例如，通过拼接八个视野，可以在0.8数值孔径的物镜下，以每帧5.3毫秒的速度采集超过1.1毫米 x 1.0毫米的超大范围。为了实现高速三维体成像，系统通过一个快速压电平台轴向振荡物镜，由于FACED 2.0的毫秒级帧采集时间，连续的轴向移动不会产生帧内运动伪影。

重要的是FACED 2.0在追求速度的同时并未牺牲分辨率。在整个拼接视野内，它对200纳米荧光珠成像的横向分辨率在半高全宽尺度上优于1.3微米，轴向分辨率优于5微米。这足以在三维空间内分辨尺寸小至10微米的神经元胞体，为准确测量单个神经元的活动奠定了基础。

随后，研究展示了FACED 2.0在大规模电压成像上的里程碑式能力。利用表达基因编码电压指示剂JEDI-2P-Kv的小鼠，他们同时记录了视觉皮层182个第2/3层神经元的电压活动，帧率高达每秒800帧。这不仅捕捉到神经元放电的尖峰信号，还首次在如此大规模的群体中，同步记录到了与输入信息相关的阈下膜电位波动。数据分析揭示了神经元群体输入与输出活动关联性的新特征，并测量了数百个神经元将膜电位转化为放电频率的输入-输出函数幂律指数。

最后，FACED 2.0在高通量三维钙成像方面的威力得到了充分展现。在清醒的转基因小鼠视觉皮层，研究人员对一个1.1毫米 x 1.0毫米 x 0.4毫米的体积进行成像，以每体积259.7毫秒的速度，从该体积内手动分割了13,962个神经元，并基于其活动识别出12,511个独立神经元，其中超过九千个表现出视觉诱发的方向选择性反应。此外，在野生型小鼠中，成像深度可达皮层下约750微米，同时记录了跨越整个皮层深度的14,005个神经元的钙活动。对于斑马鱼幼鱼这类小脑模型，FACED 2.0能够以每体积96毫秒的速度对其全脑进行快速三维钙成像，识别出自发活动的神经元集群。

创新与亮点
解决“速度-分辨率-范围”不可能三角。
传统高速成像技术往往需要在成像速度、空间分辨率（尤其是轴向分辨率）和成像范围之间做出妥协。FACED 2.0的核心创新在于，它采用高数值孔径的聚焦光点，以兆赫兹的线扫描速率顺序扫描样品，并通过非成像探测器收集荧光。这种设计使其保持了传统双光子显微镜的光学层切能力和深层成像优势，同时在实现高速成像时完全不牺牲轴向分辨率。与其他高通量荧光成像方法相比，FACED 2.0在高吞吐量、高时空分辨率和大的成像深度三者之间取得了最佳平衡。

实现大规模神经元电压活动直接观测。
电压成像直接反映神经元的膜电位变化，是研究神经信息处理的“金标准”，但因其信号微弱、对速度要求极高，长期以来难以进行大规模群体记录。FACED 2.0凭借其极高的成像速度和信噪比，首次利用双光子激发实现了对超过200个神经元的群体电压成像，并能同时解析其阈下和阈上活动。这为在系统水平上研究神经环路的输入-输出转换、相关性机制等基本问题打开了全新的窗口。

“暗态弛豫”带来更高的光子效率。
大多数双光子显微镜系统使用约80 MHz重复频率的激光，这意味着每个像素在每帧内会受到多个激光脉冲的激发。而在FACED 2.0中，每帧内每个像素仅被一个激光脉冲激发。在每秒1000帧的速率下，后续的激发脉冲要间隔1毫秒才会再次到达同一样品位置。这为荧光分子从其易于受损的暗态恢复到基态提供了充足的时间，即“暗态弛豫”效应。该效应已被证明能将双光子成像的光子产量提高数个数量级。因此，FACED 2.0能够以与传统方法相似的激发功率，在更高的帧率下成像，同时保持良好的信噪比。

总结与展望
FACED 2.0通过其独特的全光学兆赫线扫描设计，成功突破了传统双光子显微镜在速度、规模和分辨率方面的限制，为神经科学和生物医学研究提供了一款强大的体内成像工具。它不仅在技术层面实现了对数百神经元电压活动和数万神经元钙活动的同时记录，更在科学层面带来了关于神经元群体编码与转换规律的新发现。

展望未来，随着更明亮、更灵敏的荧光指示剂的不断开发，FACED 2.0的成像能力有望进一步提升，覆盖更广阔的脑区或更多的神经元。同时，改进系统的机械稳定性、激光性能和光束稳定技术，将使其操作更加简便，更适合长期、稳定的实验需求。这项技术标志着高速高分辨活体成像进入了一个新纪元，将继续推动我们在探索大脑奥秘和生命动态过程的道路上不断前进。

doi: 10.1038/s41592-025-02925-7.