期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
伯豪生物技术：单细胞转录组学测序

导语
自然杀伤细胞（NK）细胞的成熟过程由多种转录因子调控，决定了其功能，但很少有针对这一过程的检查点被深入研究。在这里，我们发现NK特异性的葡萄糖调节蛋白94（gp96）缺失导致小鼠NK细胞成熟度下降。这些gp96缺陷的NK细胞在刺激时表现出破坏的活化、细胞毒性和IFN-γ的产生，以及NK细胞成熟，对IL-15的反应减弱。在体内，NK特异性gp96缺陷小鼠显示肿瘤生长增加。在机制上，我们确定Eomes是下游转录因子，gp96与Trim28结合，以防止Trim28介导的Eomes泛素化和降解。因此，我们的研究表明，gp96-Trim28-Eomes轴是小鼠NK细胞成熟和癌症监测的重要调控因子。

关键技术
单细胞转录组学测序
（技术服务由伯豪生物提供）

研究成果
1. NK特异性gp96缺失降低了NK细胞的成熟和功能
为了研究gp96在调节NK细胞发育和功能中的作用，我们制作了Ncr1Cregp96fl/fl小鼠。这些小鼠存在gp96的条件缺失，特别是在NKp46+细胞中。通过免疫印迹法证实了NK细胞中gp96蛋白的缺失（图1A）。脾脏中未成熟的CD11bCD27-和不成熟的CD11bCD27+ NK细胞较少，CD27+ CD11b+和CD11b+ CD27-成熟的NK细胞较少（图1B）。在骨髓中的NK细胞中也观察到类似的结果（图1C）。此外，gp96缺陷的NK细胞在蛋白（图1D）和mRNA（图1E）水平上表达成熟标志物KLRG1、DX5（Itga2）、NKp46和CD11b降低。

NK特异性gp96敲除小鼠在体内比WT小鼠更容易发生肿瘤发展，小鼠LLC（Lewis肺癌细胞）（图2A）和MC38结肠癌肿瘤（图2B）显著加速生长，以及终点MC38肿瘤体积增加（图2C）。这些结果表明，NK特异性gp96缺失促进了体内肿瘤的生长。此外，与WT小鼠相比，在gp96 KO小鼠的MC38肿瘤中观察到肿瘤浸润NK细胞减少（图2d-f），这些NK细胞表达较低的脱颗粒标志物CD107a（图2G），表明肿瘤浸润NK细胞的细胞毒性功能减弱。在肿瘤转移的B16F10黑色素瘤模型中也观察到类似的结果。Gp96敲除小鼠表现出更多的黑色素瘤结节（图2H，I），肺中IFN-γ+和CD107a+ NK细胞的频率更低（图2G）。我们进一步检测了gp96缺陷的小鼠NK细胞的细胞毒性潜能。直接在体外，与WT NK细胞相比，gp96缺陷的NK细胞对原型YAC-1靶细胞的细胞毒活性降低（图2K）。此外，体内杀伤实验也表明，来自gp96基因敲除小鼠的NK细胞的杀伤活性较低（图2L）。
 

图2

2. Gp96缺失抑制了NK细胞对IL-15的反应
为了研究gp96介导的NK细胞发育和细胞毒性的潜在机制，我们开始研究gp96是否调控NK细胞对IL-15的反应，而IL-15在NK细胞成熟和效应功能中起着关键作用28。gp96缺陷小鼠的骨髓细胞在IL-15含/不含自洽场的情况下培养。与WT细胞不同，gp96-/-骨髓细胞不能有效地发育成熟的NK细胞（图3A）。.另外用不同剂量的IL-15体外刺激WT和gp96 KO小鼠的脾细胞1周。WT小鼠白细胞中NK细胞总数的频率略高于gp96 KO小鼠（图3B），值得注意的是，gp96缺失消除了DX5+IL-15处理成熟NK细胞的作用，WT- NK细胞（图3C）。即使在没有IL-15的培养7天后，脾细胞中也检测到较低比例的NK细胞（图3C），这可能是由于脾细胞刺激了微量的自分泌IL-15和其他细胞因子。

IL-15通过激活几个下游信号通路来促进NK细胞的发育，包括JAK-STAT5和PI3K-ATKmTOR通路9,28。在IL-15刺激下，与WT细胞相比，gp96缺陷的脾NK细胞显示STAT5的磷酸化水平突然下降，而p-S6是mTOR激活的可靠标志（图3d-f）。同样，在NK92细胞中，用一种特异性抑制剂抑制gp96也也降低了STAT5和mTOR的激活（图3G，H）。
 

图3

3. gp96缺陷的NK细胞与eomes缺陷的细胞具有特异性和共享的转录组特征
分析NK细胞（7349 WT和8350 Ncr1Cregp96fl/fl NK细胞），检测WT中平均1376个基因转录本，Ncr1Cregp96fl/fl NK细胞中1368个基因转录本。对所有已测序的NK细胞的无监督聚类显示了基于转录本签名的6个不同的聚类（图4A），

每个簇都表达独特的基因标记（图4B）。来自gp96-/-和WT小鼠的NK细胞表现出不同的簇状模式(图4C）。接下来，我们使用RNA速度方法追踪细胞命运和重建细胞谱系方向。在WT细胞中，NK的成熟遵循一个单一的主要分支（簇3/5到2到簇0/1和4），但没有明显的分裂。相比之下，速度分析显示，在gp96敲除条件下，通过簇3到簇4到簇0/1有一个不同的分支（图4E）。
 

图4

参考文献：
Yuxiu Xu, Xin Li, Fang Cheng, Bao Zhao, Min Fang , Zihai Li , Songdong Meng.Heat shock protein gp96 drives natural killer cell maturation and anti-tumor immunity by counteracting Trim28 to stabilize Eomes[J].Nat Commun

. 2024 Feb 6;15(1):1106. doi:10.1038/s41467-024-45426-5.