目前在科学研究和肿瘤病理诊断等多方面，以二维形态病理检测方法为“金标准“，主要进行的是组织二维切片、染色和形态学观察，无法全面呈现肿瘤组织的三维结构信息，导致对肿瘤的形态、边界、侵袭范围等判断不够精准，同时难以精确分析肿瘤细胞与周围血管、神经等微环境的复杂关系，对于理解肿瘤生长、转移机制存在障碍，导致病理检测结果出现一定程度漏检、“假阴性”甚至误检。

为了实现更全面、高效的病理检测，多年来科学界一直在尝试通过连续切片成像，然后重建三维图像。然而，这种基于切片的方法由于组织无法连续切片，获取重建的三维图像需要大量的切片，成本高且劳动强度大。

近年来，组织透明技术取得了显著进展，使得器官变得透明，从而可以使用各种光学显微镜进行体积成像，如共聚焦荧光显微镜、多光子荧光显微镜和光片荧光显微镜等。这些技术的发展为3D病理学的发展奠定了基础。

近期，华盛顿大学的研究团队发表的 “An end-to-end workflow for nondestructive 3D pathology” 介绍了一种名为无损3D病理学的工作流程，旨在生成一致、高质量的3D病理学数据集，以推动其在临床和临床前研究中的应用。

工作流程
1、组织制备（染色和光学透明化）
使用类似于传统H&E染色的方法，用核染料（TO-PRO-3）和细胞质染料（伊红）对组织进行染色，然后用乙基肉桂酸酯（ECi）使组织透明，以便进行高通量体积显微镜检查。这种使用小分子染料的方法对于厚组织的有效渗透至关重要。

2、3D显微镜成像
光片显微镜是该流程的理想成像平台，它能够快速、温和地对透明化的标本进行成像。研究团队最初开发是用于开顶光片（OTLS）显微镜，其照明和收集光学器件放置在平面样本下方，特别适合任意大小和形状的病理标本成像。此外，通过使用3D“微球”模型和自动方法来量化显微镜的点扩散函数，可以建立每个显微镜系统的基线性能，并确定理想的成像条件，如考虑探测器计数、光漂白等。

3、数据处理
对于毫米到厘米级组织的整体3D数据集，首先通过在一个主要方向（垂直或水平）扫描标本生成3D 空间数据，然后进行数据“拼接和融合”，以创建一个整体3D体数据。之后，可以将3D整体数据集进行虚拟染色处理，以模拟标准H&E组织学的粉色和紫色外观，便于病理学家解读。

4、质量控制
这是确保大规模研究中数据集始终保持高质量的关键步骤。包括评估分辨率、对比度和均匀性等定量方法，以提供满足病理学家期望的高质量假彩色成像结果所需的数据质量水平建议。这些指标也反映了有效下游计算分析所需的质量水平。

应用场景与案例
1、肿瘤学领域
★ 前列腺癌研究的重大突破
无损3D病理学在前列腺癌的诊断和研究中展现出了卓越的能力。研究人员利用该技术对不同大小的前列腺癌标本进行检测，通过精确的3D成像，能够细致观察前列腺组织中癌细胞的分布、腺体结构的变化以及细胞核的形态特征。这不仅有助于更准确地进行格里森分级，减少分级过程中的不确定性，还为后续治疗方案的制定提供了关键依据。例如，在活检样本的研究中，3D病理学清晰地呈现出肿瘤组织的微观结构，帮助医生更精准地判断病情严重程度，从而制定个性化的治疗策略。

★ 乳腺癌淋巴结转移的精准评估
对于乳腺癌患者，淋巴结转移情况是判断预后和制定治疗方案的重要因素。无损3D病理学在这方面发挥了重要作用，它能够对整个淋巴结进行全面的3D成像，准确测量转移灶的大小、位置和形态。与传统2D病理学相比，3D病理学避免了因切片局限性而导致的转移灶低估问题，为临床医生提供了更全面、准确的信息，有助于制定更精准的治疗计划，提高患者的治疗效果和生存率。

★ 食管癌诊断的高效助力
在食管癌的诊断中，无损3D病理学结合深度学习技术，显著提高了检测的敏感性。通过对大量食管组织样本的3D成像，能够更清晰地观察食管黏膜的病变情况，早期发现微小的肿瘤病灶。同时，该技术减少了病理学家的工作量，提高了诊断效率，为食管癌的早期诊断和治疗赢得了宝贵时间。

2、临床前研究
★ 肝脏细胞培养与药物筛选
在肝脏疾病研究和药物研发领域，为3D小鼠肝细胞培养的研究提供了有力支持。通过对肝细胞培养物的3D成像，研究人员能够观察细胞在三维空间中的生长、分布和相互作用，模拟体内肝脏组织的微环境。这有助于更准确地评估药物对肝脏细胞的作用效果，筛选出更有效的药物分子，为肝脏疾病的治疗提供更多的药物选择。

★ 肾脏结构与功能研究
在肾脏研究方面，可对整个小鼠肾脏进行不同尺度的成像，清晰地展示肾小球的结构和功能。这对于研究肾脏疾病的发病机制、评估药物对肾脏的影响以及开发新的肾脏治疗方法具有重要意义。例如，在评估肾脏疾病模型中肾小球的损伤程度和修复过程时，3D病理学能够提供全面、详细的信息，帮助研究人员深入了解肾脏疾病的病理生理过程。

★ 皮肤药物递送研究
在皮肤疾病治疗研究中，被用于评估可溶性微针阵列在小鼠皮肤中的药物递送效果。通过3D成像技术，可以观察微针在皮肤中的穿透深度、药物释放位置以及对皮肤组织的影响，为优化皮肤药物递送系统提供了重要依据，有助于提高皮肤疾病治疗的效果和安全性。

3、其他医学领域
★ 法医学中的虚拟解剖技术
在法医学领域，3D病理学技术为虚拟解剖提供了可能。通过进行非侵入性的3D成像，能够清晰地观察骨骼、血管等解剖结构，发现潜在的损伤和病变。这不仅可以在不破坏完整性的前提下获取关键信息，还能为法医鉴定提供更准确、全面的依据，有助于解决复杂的法医案件。

★ 心血管疾病研究的新视角
在心血管疾病研究中，3D病理学可以对心脏组织和血管进行三维成像，帮助医生观察血管壁的厚度变化、斑块的形成和分布，以及心脏组织结构的异常。这有助于深入了解心血管疾病的发病机制，为疾病的早期诊断和治疗提供重要支持。

★ 神经科学研究的有力工具
在神经科学领域，3D病理学能够展现神经细胞在大脑组织中的三维分布和连接情况，为研究神经系统疾病的病理机制提供了全新的视角。例如，在研究阿尔茨海默病等神经退行性疾病时，通过3D成像技术可以观察到神经细胞的损伤和丢失情况，以及神经纤维缠结的分布，为疾病的诊断和治疗研究提供重要线索。

与其他方法的比较
与无损3D显微镜的透明组织成像相比，自动化连续切片显微镜是另一种选择，它通过从厚标本中快速切割薄组织切片来获得2D图像。虽然这种方法无需化学透明处理，但可能引入切片伪影，并使3D体积的重建变得复杂。在标记协议方面，抗体染色是临床组织中小分子染色的主要替代方法，但抗体扩散到厚组织中可能非常缓慢，染色协议也较为复杂。

此外，还有多种光片显微镜的替代方法，如共聚焦和多光子显微镜等点扫描技术。这些商业点扫描系统在核心设施中广泛可用，但成像速度相对较慢，且一些激光扫描模式，特别是共聚焦显微镜，光效率较低。

总结与展望
3D病理学能够提供更丰富的组织信息，包括组织的三维结构、细胞间的空间关系以及病变在三维空间中的分布情况。这有助于病理学家更全面、准确地理解疾病的病理过程，做出更精准的诊断。3D病理学技术在提高诊断准确性的同时，还能够减少因样本制备和观察方法的局限性而导致的误诊和漏诊。在临床前研究和药物研发中，3D病理学能够更真实地模拟体内环境，为研究细胞行为、药物作用机制和疾病模型提供更有效的平台，有助于加速新药研发进程，降低研发成本。

但3D病理学技术对设备和技术要求较高，需要配备先进的显微镜系统、强大的计算设备和专业的图像处理软件。数据处理和存储是3D病理学面临的另一个挑战。尽管3D病理学技术在不断发展，但目前仍缺乏统一的标准和规范，这在一定程度上限制了其在临床实践中的广泛应用和推广。不同实验室和研究机构之间的技术差异可能导致数据的可比性和重复性受到影响。

3D病理学作为医学领域的一项革命性技术，已经在疾病诊断、研究和治疗等方面取得了显著的成果。尽管目前仍面临一些挑战，但随着技术的不断进步、应用领域的拓展以及相关问题的逐步解决，其未来发展前景十分广阔。相信在不久的将来，3D病理学将为人类健康事业带来更大的福祉，推动医学向更精准、个性化的方向发展。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Kevin W. Bishop, Lindsey A. Erion Barner, Qinghua Han, Elena Baraznenok, Lydia Lan, Chetan Poudel, Gan Gao, Robert B. Serafin, Sarah S. L. Chow, Adam K. Glaser, Andrew Janowczyk, David Brenes, Hongyi Huang, Dominie Miyasato, Lawrence D. True, Soyoung Kang, Joshua C. Vaughan & Jonathan T. C. Liu;An end-to-end workflow for nondestructive 3D pathology;https://doi.org/10.1038/s41596-023-00934-4.