重组抗体药物制备的下游纯化工艺，主要目的是分离纯化去除工艺相关杂质，如内毒素、病毒、HCP、HCD等和产品相关杂质等。

其中，HCP，即宿主细胞蛋白（Host Cell Protein）是表达重组抗体宿主细胞产生的、具有不同理化性质的复杂内源性蛋白质复合物，因其自身带来的免疫原性和潜在的蛋白酶水解活性等，会严重影响抗体药物的稳定性和功效，被认为是抗体药物的关键质量属性。HCP的去除也因此成为抗体下游工艺的关键目标之一。通常最终抗体药物原液中残留HCP的普遍接收范围在1~100ppm。

以常见的中国仓鼠卵巢（CHO）宿主细胞生产抗体为例，在下游工艺中，主要通过亲和层析、深层过滤、离子交换层析及多模式层析等纯化步骤来降低HCP水平。

亲和层析由于对抗体的高度结合特异性，是抗体下游纯化最常用的捕获层析方法。亲和层析高度选择性的特点，是去除HCP的有效手段。

HCP和亲和层析填料间的非特异性结合对HCP残留起到的作用很小。然而，HCP与目的蛋白之间存在多位点的非特异性相互作用，会导致下游纯化中两者共纯化，成为亲和洗脱液中HCP存在的主要原因。

为尽量减少样品中HCP的水平，通常在目的蛋白洗脱之前进行中间淋洗。该步骤优化的重点在于破坏HCP与亲和层析介质和/或抗体之间的相互作用。通常选用介于平衡和洗脱缓冲液之间的pH范围（如pH 5.0~6.5）进行淋洗，以去除与亲和层析介质非特异性结合的HCP。但这对与目标抗体蛋白有相互作用的HCP的去除效果有限，且低pH的中间淋洗步骤有可能会影响收率，尤其在高上样载量时。

对于此种情况，可以采用碱性淋洗缓冲液（pH 8.0~10.0）来打破抗体与HCP之间的相互作用，从而达到除去HCP的目的。

此外，在淋洗步骤过程中，除对缓冲体系及pH进行优化外，添加一定量的盐或添加剂（例如：尿素、精氨酸、丙二醇和triton X-100等）也可显著破坏HCP与目的蛋白之间的静电，疏水和氢键相互作用。通过淋洗，可以除去柱上结合的HCP，从而显著降低洗脱液中HCP的水平。

Table 1. 常用淋洗添加剂及添加浓度

Table 2. 与mAb的Fab和Fc结构域被鉴定为强结合HCP的蛋白质

亲和层析洗脱的样品，在经过低pH（pH 3.5~3.8）病毒灭活后，需进行回调中和pH来与后续层析步骤进行衔接。大部分HCP（pI 4.5~7.0）在调节pH时会被跨越等电点，使溶解性降低。

对低pH病毒灭活后的回调pH值进行优化，可以选择最佳中和pH来选择性的有效聚集或沉淀HCP。除此之外，也可以通过添加剂如辛酸、聚乙二醇等最大限度地沉淀HCP，同时最大限度地减少目标产物损失。这些经处理后的料液再通过深层过滤器对HCP的吸附特性来达到有效去除HCP的效果。

亲和层析和深层过滤通常可以去除90%以上的HCP，但若仍无法达到目标HCP残留要求以下，则还需要通过精纯步骤进行去除，常用方法即为离子交换层析。

由于大多数抗体与HCP相比具有较高的等电点（pI 6.5~9.0），因此可采用阴离子层析流穿模式去除HCP，即在低于抗体蛋白等电点的pH和低电导条件下进行上样。因大部分HCP的等电点低，此上样条件下HCP多带负电与介质结合，而抗体蛋白带正电不与介质结合，而是从阴离子层析柱中流穿，从而将抗体与HCP进行分离。阴离子层析可通过对上样条件的缓冲液种类、离子强度和pH等条件进行优化。对于阴离子弱结合模式，还可以通过增加上样量和上样后淋洗等方式来优化提高收率。

阳离子交换层析则主要以结合洗脱模式去除产品相关的杂质。除了对缓冲液种类、离子强度和pH等条件优化，上样条件、淋洗策略与洗脱条件优化对于去除HCP和提高产品质量也很重要。此外，阳离子交换层析也可以通过弱结合流穿模式去除HCP和聚集体。

相较其他单一模式层析，多模式层析具有更高的选择性。抗体表面疏水和带电荷的分布与大多数HCP表面分布不同。多模式离子层析介质利用疏水与离子协同作用，可在去除HCP等杂质上表现出较单一模式层析更优秀的性能。但也正因为多模式层析固有的复杂性（兼具多种由不同因素影响的相互作用），为了充分利用该种层析，需要进行广泛的优化。

比如，对pH的优化，可以控制离子相互作用和结合能力，有利于提高回收率；而对电导率（上样、淋洗及洗脱盐浓度）的优化则决定了结合以及洗脱时的疏水相互作用。此外，添加剂如精氨酸等的使用也可以提高多模式层析的分离性和/或选择性。

实现HCP的充分去除是抗体药物生产的一个关键目标，这主要取决于上游细胞培养工艺控制与下游纯化工艺控制。在抗体下游纯化工艺中，需要灵活应用不同方法，结合不同分离原理清除HCP。

为了最大限度地去除HCP并提高工艺稳健性，对工艺中的每个步骤进行优化是至关重要的。这些不同HCP去除策略的综合运用对保证抗体药物的稳定性和功效至关重要。
 

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