核酸提取类型
核酸提取是分子生物学研究中的关键步骤，根据不同的核酸类型和应用需求，主要包括4种类型。
·总RNA提取：总RNA包括大量的rRNA和少量的mRNA、tRNA、snRNA等。总RNA的提取通常采用三相酚-氯仿抽提法，通过酚相和氯仿相的分离，有效地将核酸分离出来，适用于从细胞裂解液中提取RNA。
·miRNA提取：miRNA是短小且高度保守的RNA分子，其提取需要使用特殊的方法，如基于柱层析的技术或磁珠法。这些方法能够高效地富集和分离miRNA，以便于后续的定量分析和功能研究。
·基因组DNA提取：基因组DNA提取通常采用碱裂解法或酚-氯仿法，这些方法能有效地分离和纯化高分子量的DNA。保证DNA的完整性对于后续的基因组研究和诊断至关重要。
·质粒提取：质粒提取旨在从细菌或真核细胞中分离质粒DNA，常用的方法包括碱裂解法和硅胶柱层析。这些方法能够有效地去除杂质，得到高纯度的质粒DNA用于分子克隆和转染实验。

质粒最早是20世纪50年代初期在大肠杆菌中发现的，是细菌、酵母菌、放线菌等生物中独立于染色体(或拟核)以外的闭合环状双链DNA分子，具有自主复制能力，可在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。目前，质粒已成为基因工程中一种常用、简单的载体，除了在科研领域的普遍应用，质粒也被广泛用于多类生物医药产品的研发生产环节，如重组蛋白药物、疫苗、基因治疗药物以及CAR-T药物等。

细菌质粒是一类环状双链DNA，大小从1Kb至200 Kb以上不等，一般存在于细胞质中，独立于细胞染色体之外自主复制的遗传成分。实验室常用碱裂解法提取质粒DNA，菌体在氢氧化钠和SDS溶液中裂解，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清液中，蛋白质与细菌基因组DNA缠绕呈絮状，离心时可沉淀下来，上清中的质粒用吸附法纯化。

质粒的粗提取物通常包含3种构型的质粒DNA：
·共价闭合环状DNA (cccDNA)：这是质粒DNA最常见的构型。质粒的两条链没有断裂，形成一个完整的闭环结构。具有高度的稳定性和完整性，是基因工程中常用的质粒构型。
·超螺旋开环DNA (ocDNA)：质粒的一条链断裂，形成一个超级螺旋的开环结构。ocDNA的稳定性稍逊于cccDNA，但仍可用于某些实验。
·松弛的环状分子线形DNA (lDNA)：质粒的两条链均断裂，形成一个松弛的环形结构。IDNA的稳定性较差，通常在质粒提取过程中产生较少。
电泳时，由快到慢依次是：超螺旋＞线性DNA＞开环DNA。

2. 质粒提取原理
质粒提取即去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取从具体操作方法分为：碱裂解法、煮沸裂解法、小量一步提取法、试剂盒法、酶解法及其它提取方法等。从提取产量上分为：小提、中提、大提。

1)碱裂解法
原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
优点：操作简单，成本低，适用于大部分常规实验。
缺点：提取纯度可能不够高，需要进一步纯化。

2)煮沸法
原理：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL(小量制备)，多至250mL(大量制备)菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。
优点：操作简单，时间短。
缺点：条件过于剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。

3)小量一步提取法
原理：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

4)试剂盒法
原理：通常采用改良的SDS-碱裂解法，结合硅胶膜在高盐及低pH值(pH<7.5)时可结合DNA，在低盐及高pH值(pH≥8)条件下洗脱的原理达到快速纯化质粒DNA的目的。

质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色，碱裂解法是根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。其原理是：在强碱环境(pH=12.0-12.6)下，细菌的细胞壁和细胞膜被SDS破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，宿主细胞的蛋白质、染色体及线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性(质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性)。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH=4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快(可恢复天然构象)，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA(在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收)。

5)酶解法
原理：利用特异性酶裂解细胞壁或细胞膜，释放质粒DNA。
步骤：(1) 细胞收集：培养含有质粒的细菌，离心收集细胞。(2) 酶处理：加入溶菌酶等酶类，裂解细胞壁。(3) 裂解细胞：加入裂解缓冲液，释放质粒DNA。(4) 纯化：使用柱子或其他纯化方法分离质粒DNA。
优点：提取纯度高，适用于高需求实验。
缺点：成本较高，操作时间较长。

6)其他方法
离子交换法：利用质粒DNA与离子交换介质的结合来分离和纯化。
超离心法：利用质粒DNA与其他分子的密度差异，通过超离心分离。

总结来说，碱裂解法主要使用三种溶液(根据1979年J.Doly发表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)。The principle of alkaline extraction就是选择性地让chromosomal DNA发生变性，而plasmid DNA不会发生变性，仍然以双链形式存在。

碱裂解法提取质粒DNA具有产量高、操作快速等优点，其原理是：在碱性溶液中，双链DNA的氢键断裂，DNA双螺旋结构遭到破坏而发生变性，但是由于质粒DNA的分子量相对较小，而且呈环状超螺旋结构，即使在碱裂解的高pH条件下，两条互补链也不会完全分离；当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又可恢复到原来的构型，而变性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物；并通过离心，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等都可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA留在上清液中；混杂的RNA可用RNA酶(RNase A)消除，残留的蛋白质可以用酚和氯仿处理去除。

·溶液I (P1)--溶菌液(包含葡萄糖以及EDTA)
主要成分：25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM葡萄糖(Glucose)，P1也可以不含葡萄糖。
主要作用：P1的主要作用是将菌体沉淀悬浮。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA因机械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg^2＋、Ca^2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)；(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

P1的两个试剂从用途上看，用水或者LB也可以代替，少了EDTA，提取速度加快一点，也不会降解那么快。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，少了也没有关系，只要重悬充分也是一样的效果。

注意事项：溶液P1需要在使用前加入RNA酶(RNaseA)以降解溶液中的RNA，并保存在4°C以防止蛋白质失活。

·溶液II(P2)--NaOH-SDS液
主要成分：250mM NaOH、1%(w/v) SDS(十二烷基磺酸钠)。
主要作用：P2的主要作用是对细胞进行裂解。
NaOH：核酸在pH>5和pH<9的溶液中是稳定的，但当pH>12或者pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2 mo1/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO^3-…R⁺-蛋白质的复合物，使蛋白质发性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。

溶液II最重要是NaOH，一定要用要新从浓NaOH稀释制备0.4 N NaOH，保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相发化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。

注意事项：添加溶液P2时需要控制时间和避免剧烈震动，操作要温柔，以防止基因组DNA断裂并污染样品。

·溶液III(P3)--3mol/L NaAc(pH=4.8)溶液
主要成分：3M醋酸钾(potassium acetate)、5M醋酸。
主要作用：P3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除蛋白质等细胞内的杂质。
醋酸：作用是中和强碱。长时间暴露在强碱性溶液(如氢氧化钠)中会对DNA结构造成破坏，因此需要中和处理。
醋酸钾：作用是清除蛋白质等杂质。在加入P3后，会观察到大量沉淀的形成。这些沉淀是由于醋酸钾中的钾离子与混合物中的SDS多肽发生相互作用所致，进而生成不溶于水的十二烷基硫酸钾(PDS)。PDS的沉淀不仅会沉淀变性的蛋白质，还会与缠绕在变性蛋白质上的基因组DNA一同沉淀，导致大部分基因组DNA也被共沉淀。此外，高离子浓度的溶液会加速这一沉淀过程。在中和溶液后，变性蛋白质表面的电荷减少，也会促进变性蛋白质的沉淀。

·Wash buffer(PE)
主要成分：10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol)。
主要作用：去除多余的盐离子。实验中大家普遍使用硅胶柱进行DNA提取。在DNA吸附到硅胶柱后，需要使用PE洗涤液清洗掉多余的盐离子。PE中含有高浓度的乙醇，由于乙醇可能影响后续的酶切或测序反应，因此在洗去DNA之前，在离心机中需要对柱子进行“空甩”，以除去乙醇。

·Elution buffer (EB、TE)
主要成分：10mM Tris-HCl (pH=7.5)或者ddH₂O。
主要作用：洗脱硅胶柱上的DNA样品。
EB缓冲液：EB中不应含有过高浓度的盐离子，因为高盐环境中，盐阳离子会破坏硅胶负氧根和水之间的氢键，导致整体硅胶带正电荷，进而吸引携带负电荷的DNA分子。此外，加热过的洗脱液(<50℃)能促进DNA从硅胶膜上迅速释放。在离心之前，延长EB缓冲液在膜上停留时间能更有利于DNA的洗脱。使用ddH₂O进行洗脱效率较低，建议在第一次洗脱后，将洗脱液重新加入硅胶柱进行第二次洗脱。

质粒抽提按得到质粒DNA的量可分为小提、中提、大提：

·小提质粒
特点：简便、快速，适用于高通量提取。
浓度：100-200 ng/μL。
用途：适用于测序、PCR、腺病毒包装以及多数细胞转染实验。
适用场景：适用于1-5 mL菌液，提取简便、快速，可用于DNA序列分析、酶促反应、PCR等实验，要求质粒浓度不高。

·中提质粒
特点：质粒DNA量较高。
浓度：0.7-1 μg/μL。
用途：适用于测序和多数细胞转染实验。
适用场景：适用于30-50 mL菌液，可用于酶切、PCR、测序、连接、转化等实验。

·大提质粒
特点：质粒DNA量非常高、杂质少、无内毒素。
浓度：0.5-2 μg/μL。
用途：适用于慢病毒、腺相关病毒包装，以及多数细胞转染或其他需要大量质粒的实验。
适用场景：适用于100-500 mL菌液，适用于大规模提取，提取的质粒纯度高，无内毒素，可用于对质粒纯度有要求的实验。

3. 实验材料
·仪器设备及实验用具
高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩涡振荡器；
培养用试管、量筒、冰盒、微量离心机、微量移液器、吸管头若干。
常见的质粒提取试剂盒包括OMEGA、BIOMIGA、Sigma、TaKaRa、Promega、天根、康为世纪、生工等品牌，它们大多都是在碱裂解法基础上进行优化改进而成。

·试剂配制
LB培养基: 称取胰蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，用双蒸水溶解至300mL，用10mol/L NaOH溶解调pH值至7.0-7.2，固体培养基需要加入琼脂(1.5%)，高压灭菌。
氨苄青霉素(Amp，100mg/mL): 氨苄青霉素100 mg，加入1 mL双蒸水溶解。
100×TE缓冲液(含1 mol/L Tris-HCI和100 nmol/L EDTA): 称取Tris 121.1 g，EDTA-Na2 37.22 g，先用800 mL双蒸水加热搅拌溶解，用盐酸调pH值至8.0(大约需要盐酸20 mL)，再加双蒸水定容至1000 mL。
溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH=8.0)，10mM EDTA (pH=8.0)。1M Tris-HCl(pH=8.0) 12.5mL，0.5M EDTA(pH=8.0) 10mL，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500mL。高压灭菌15min，贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1mL，加ddH2O 至10mL。使用前临时配置。
溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300mL，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存备用。
苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)
乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
5×TBE：Tris碱54g， 硼酸 27.5g，EDTA-Na₂·2H₂O 4.65g，加 ddH₂O 至1000mL。高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
溴化乙锭(EB)：10 mg/mL
RNase A：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/mL，TE 配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，40%(w/v)蔗糖水溶液。
1% 琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加100mL 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加 EB 母液(10mg/mL)至终浓度0.5μg/mL (注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液 0.5×TBE)，即可上样。

4. 质粒提取实验步骤(以碱裂解法为例)
质粒提取主要包括四个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA、质粒DNA的分离与纯化和质粒DNA的电泳检测，今天以碱裂解法为例进行介绍。

实验步骤：
(1)摇菌培养
1) 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。
2) 置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3) 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4) 挑取单克隆菌落放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5) 37℃，180 rpm，振荡培养过夜(约 12-16h)。

(2)收获细菌并裂解
主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法，根据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。
·碱裂解法：
1) 柱平衡。向吸附柱中加入500 μL的Buffer B溶液。12000 rpm离心1 min，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2) 取3 mL过夜培养的菌液，12000 rpm离心1 min，弃尽上清。每次1 mL分3次完成。
3) 加入250 μL Buffer P1悬浮菌体沉淀。
4) 加250 μL Buffer P2，温和并充分上下翻转6-8次，使菌体充分裂解直至形成清亮粘稠的溶液。
5) 加入350 μL Buffer P3，温和并充分上下翻转6-8次，充分混匀出现白色絮状沉淀，12000 rpm 离心10 min。
6) 吸取上一个步骤中的上清转移至吸附柱，12000 rpm离心1 min，弃废液。
7) 吸附柱放回离心管加入600 μL Buffer W，12000 rpm离心1 min，弃废液。
8) 重复上述步骤。
9) 将吸附柱放回离心管，12000 rpm离心2 min，将吸附柱中残存漂洗液去除。
10) 将吸附柱移入1.5 mL离心管，在吸附柱中央加入50 μL去离子水/Elution buffer。室温放置2 min，12000 rpm离心2 min，收集质粒溶液。
11) 收集到的溶液即为质粒溶液。测量溶液浓度和纯度，剩下的质粒溶液置于-20℃冰箱保存。

·煮沸法：
1) 将1.5ml培养液倒入EP管中，4℃下12000 rpm离心30 s。
2) 弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3) 将菌体沉淀悬浮于120 mL STET溶液中，涡旋混匀。
4) 加入10 mL新配制的溶菌酶溶液(10 mg/mL)，涡旋振荡3秒钟。
5) 将EP管放入沸水浴中，50s后立即取出。
6) 用微量离心机4℃下12000 rpm离心10 min。
7) 用无菌牙签从EP管中去除细菌碎片。
8) 取20 mL进行电泳检查。

(3)质粒的纯化
1) 将之前提取好的质粒放入1.5 mL离心管中，加入1/10体积的3 mol/L 无菌乙酸钠溶液。
2) 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6 h或过夜。
3) 4℃，高速离心机14000 rpm，离心20 min。
4) 弃去上清，70%乙醇洗2次。
5) 空气干燥，可置超净工作台干燥。
6) 加200 μL无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。
7) 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数(μg/mL)。

质粒DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。一般来说，OD230为碳水化合物、多肽、苯酚等，OD260为核酸，OD280为蛋白质。OD260/OD280的比值常用于判DNA或RNA溶液的纯度，其通常在1.8~2.0左右，纯DNA的比值为1.8，纯RNA为2.0。OD260/OD230比值大于2.0，如果比值小于2.0，说明被糖类、盐类或有机溶剂污染。

(4)质粒DNA 的电泳检测
观察琼脂凝胶中DNA 的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA 吸收254nm 处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm 和366nm 有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm 处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2 μL，加适当loading buffer 混匀上样，采用1-5 V/cm 的电压，使DNA 分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测并拍照。

5. 注意事项
(1) 高压灭菌消毒的过程必须专人看管，以免发生安全事故。
(2) 抗生素不能高压灭菌，需通过过滤除菌。培养基灭菌后，待冷却至不烫手时才加入抗生素，若是已灭菌并冷藏备用的液体培养基，则在使用前根据需要加入抗生素。
(3) 为避免细菌污染环境，多余的菌液需经煮沸杀菌后方可丢弃。
(4) 细菌的细胞壁成分会抑制限制性内切酶的活性，离心收集细菌时若未除尽培养基，其中残留的细菌细胞壁可能会对酶切产生影响。
(5) 加入溶液I、溶液II、溶液III后，混匀时一定要温和，以防染色体DNA分子断裂。
(6) 酚/氯仿抽提时，离心分层后吸取上层水溶液应非常小心，避免吸入下层的酚/氯仿和中间层的沉淀。
(7) 离心时应将离心管的管盖突出小柄统一朝向外侧，以保证沉淀于离心管的外侧，便于后续操作。
(8) 使用之前，需要把试剂盒中的一小管RNA酶加入到Buffer P1，4℃保存。
(9) Buffer EB在65-70℃水浴预热，可以增加提取效率。

6. 常见问题及解答
(1) 质粒提取试剂盒选择
质粒提取方法主要根据质粒DNA分子量的大小，所用细菌的种属，细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。
·质粒DNA的分子大于15kb时，在质粒抽提过程中容易受损，可以采用比较温和的裂解方法，将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜，这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的压力，保护质粒DNA。
·小分子的质粒DNA可以选用相对剧烈的方法来分离DNA。可以用煮沸法，碱裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢剂裂解细菌。这些方法会使DNA变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起，在恢复正常条件后，DNA便会复性。

(2) 质粒提取的得率低或无质粒
菌体老化：重新涂布筛选，挑选新的菌落进行液体培养。
质粒拷贝数低：筛选新的高拷贝的菌体。
碱裂解不充分：收集的菌体含量较高时，可以酌情提高溶液1/2/3的含量。
乙醇残留，漂洗液没有去除干净。
洗脱处理不当：洗脱液加入较多或者洗脱时间过短。

(3) 质粒的纯化不足
混有RNA，RNase A处理不彻底。
混有基因组DNA，避免加入溶液2，3时剧烈震荡。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量；细菌培养时间过长也会导致细胞和DNA的降解。

(4) 质粒DNA产量低
可能原因：细菌培养不充分；裂解不完全；质粒DNA丢失在提取过程中。
解决方案：确保细菌培养充分，通常需要过夜培养，达到适宜的OD600值；检查裂解缓冲液的成分和pH值，确保裂解充分；检查各步骤操作是否规范，避免质粒DNA的流失；使用更高效的提取试剂盒。

(5) 质粒DNA纯度低
可能原因：基因组DNA或RNA污染；蛋白质或其他杂质残留。
解决方案：在裂解过程中加入RNA酶，去除RNA污染；严格控制碱裂解时间，避免基因组DNA断裂混入质粒DNA；充分离心，去除细胞碎片和蛋白质；使用酚-氯仿提取或硅胶柱纯化质粒DNA。

(6) 质粒DNA降解
可能原因：操作过程中存在DNase污染；存储条件不当。
解决方案：使用无DNase的试剂和耗材；操作时戴手套，避免手部接触样品；将质粒DNA存储在-20℃或-80℃冰箱中，避免反复冻融。

(7) 质粒DNA无法转化或低转化效率
可能原因：质粒DNA质量不高；受体细胞状态不佳。
解决方案：确保质粒DNA的纯度和浓度，进行测序验证；使用新鲜的感受态细胞，确保细胞处于最佳状态；优化电转化或热转化条件。

(8) 质粒DNA浓度测定不准确
可能原因：样品中含有蛋白质、盐类或其他杂质；光谱仪校准不准确。
解决方案：进行纯化步骤，去除杂质；使用分光光度计前进行校准，并使用适当的空白对照。

(9) 质粒DNA无法完全溶解
可能原因：质粒DNA沉淀不完全溶解；溶液pH值不合适。
解决方案：使用温和的溶液如TE缓冲液溶解质粒DNA；轻轻混匀，避免剧烈摇动；确保溶液的pH值适合质粒DNA溶解。

(10) 出现剪切或片段化的质粒DNA
可能原因：操作过程中物理剪切；过度震荡或搅拌。
解决方案：轻柔操作，避免剧烈的震荡或搅拌；使用合适的提取方法，减少质粒DNA的机械损伤。

(11) 质粒纯度的选择
同样对于一般的载体构建等常规实验和送去测序检测的话，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。如果是质粒需要用来做细胞转染实验的话，则需要无热源，无内毒素(LPS)。

(12) 菌液较多
可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体，溶液II裂解菌体，其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜，使菌体中的质粒DNA释放出来，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢复中性环境，利于质粒DNA复性，溶液II中SDS的Na⁺会被K⁺置换，SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA，蛋白质和细胞碎片形成不溶物，然后通过离心可以得到含有质粒DNA的上清。因此加入溶液II后要温和地混合，不要剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，若继续进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀，无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。

(13) 菌液培养时间
使用TB培养基培养菌液的时间一般在16 h左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，导致活菌比例降低，进而基因组DNA污染概率增大，培养时间应优选的控制在12-16 h内。

(14) 宿主菌株
宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株如HB101、JM101、JM110、TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10、DH5α进行质粒纯化。

(15) 质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。当所提取的质粒大于10 kb时，由于菌体承载力有限，大质粒复制效率往往会低于普通质粒，因此推荐增大菌液量以获得更好的提取产量。

(16) 菌体中无质粒
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致无法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

(17) 碱裂解不充分
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加裂解液的用量。并确保细菌混悬均匀。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分，要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

(18) 溶液使用不当
溶液II在温度较低时可能出现浑浊，可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液，方可使用。

(19) 吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

(20) 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

(21) 乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，可置于室温静置20-30min，或放到超净台上风吹15 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(22) 盐离子污染
当漂洗操作不当或漂洗不充分时将导致盐离子污染，该指标可通过OD260/230比值鉴定，通常大于2.0是可接受的。在使用试剂盒时应确保Wash Buffer的漂洗次数和漂洗液加入量。

(23) 洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率，若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位，可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。

(24) 洗脱液不合适
DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或ddH₂O。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH=7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。为追求高浓度质粒而减小洗脱液体积将会导致洗脱不充分进而降低产量，因此要确保洗脱液的用量，此外Elution Buffer预热至60℃和重复洗脱将更有利于洗脱效率提升。

(25) 洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

(26) 洗脱时间过短
洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。

(27) 质粒保存方法
提取后的质粒除了本身质量外，也应注意提供适宜的保存环境，以防止质粒降解影响下游应用，一般质粒可保存于TE溶液中，在4℃短期保存，在-80℃或-20℃中长期保存。除了直接保存质粒，还应将含质粒的宿主菌保存于甘油中，-80℃或液氮中可长期保存。

(28) 质粒内毒要求
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和蛋白复合物，当细菌裂解时会大量释放出来。

内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性(如大肠杆菌E.coli)胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。LPS污染通常用内毒素单位(Endotoxin Units, EU)表示，通常情况下，1ng LPS对应于1-10个EU。

由于内毒素两亲性和负电荷性，性质和DNA类似，因此在质粒纯化过程中会伴随质粒一同被纯化出来。

内毒素单位为EU，质粒中内毒素含量的高低常用EU/µg表示。按照EU/µg大小，质粒被分为3个级别：测序级别(>50EU/µg)、转染级别(<50EU/µg)、无内毒素级别(<0.1EU/µg)。

(29) 影响质粒提取的因素有哪些？
质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。

(30) 为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶？
革兰氏阳性菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。

(31) 如何根据实验需要选择不同级别的产品？
从纯度上：各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化，普通纯度的质粒可以满足要求；而对于转染实验，则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。
从提取的量上：1-20μg，应选择小量提取试剂盒；20-40μg，应选择中量提取试剂盒；大于40μg，应选择大量提取试剂盒。
从宿主菌上：分为普通细菌质粒提取试剂盒、革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒，根据情况进行选择。