文章来源公众号：生物随笔          作者：陈

一、蛋白与抗体孵育
1、对于一个六孔板的细胞，根据细胞密度加入约220-250 μL 的IP裂解液，冰上裂解10min。随后12000 rpm，4℃离心 15 min 后吸取上清蛋白液；
2、取 20-50 μL蛋白液进行 BCA 定量。根据蛋白的浓度吸取一定体积的蛋白液加入适量体积的目标一抗（一抗比例根据说明书，或者蛋白量：抗体=100 ug：1 ul）。BCA 定量剩下的蛋白液作为input样品置于-20℃保存；
3、同时平行设置IgG对照组，加入适量体积的的IgG抗体。将实验组和IgG组含有抗体的蛋白液放置于4℃摇床孵育过夜；

二、磁珠吸附（第二天）
1、充分重悬管中磁珠；
2、取 40-50 μL  Protein A/G 磁珠转移到 1.5 mL EP 管中；
3、加入约 0.5 ml 洗涤缓冲液，充分重悬磁珠。将 EP 管放入磁力架上，磁性分离。弃上清液。重复此步骤 2 次。再根据实验加入适量洗涤缓冲液重悬。
4、向4℃摇床孵育过夜的蛋白-抗体复合物中，每管加入相当于40-50 uL原液的Protein A/G Beads 溶液，轻度涡旋混匀放置于4℃摇床，缓慢结合 4h;。

若ProteinA/G 与 Beads 结合导致背景高；使用前使用 1～5% 的 BSA 进行预封闭磁珠、免疫沉淀后增加漂洗次数和盐离子浓度

三、蛋白变性洗脱
1、当蛋白-抗体复合物和磁珠孵育结束后，轻甩离心后置于磁力架进行磁性分离，去上清；
2、加入1mL 洗涤缓冲液 清洗beads，共5次；
3、当完成最后一次洗涤后，弃去洗涤液加入适当体积（约40ul）的 1xloading。 1xloading用IP裂解液稀释并加入蛋白酶抑制剂。加入loading后，将蛋白样品通过金属浴加热变性即得蛋白样本，使用磁力架或者离心分离弃去磁珠。后续通过免疫印迹检测蛋白的表达。

#洗涤缓冲液：PBST: 1*PBS +0.5%Tween-20 即50ml PBS + 250μl Tween-20

​四、如何避免IGG
IGG一般有两条，分别是25和55kDa的轻链和重链，如果这个位置恰好在我们的目的条带附近就会产生干扰。那么如何避免这两条干扰条带呢？

如果是外源性蛋白，目标蛋白上一般会有标签如Flag这些，那么就可以在免疫沉淀的时候加入如兔源的Flag抗体，洗脱完WB跑完孵育抗体显影时，可以用鼠源的Flag抗体，那么对应的二抗就是抗鼠的二抗。此时抗鼠的二抗一般就不会识别免疫沉淀时加入的兔源的Flag抗体。因而就不会产生IGG条带。不过在实际过程中发现，即便是这样也会出现显影出IGG的轻链或者重链。也就是这种方法只能规避掉其中一条链，此时就可以使用特异性识别轻链或者重链的专用二抗来彻底避免IGG条带。这种方法适用于实验室有不同种属抗体，尤其是标签抗体比较便宜可以实现。如果仅仅想避免轻重链其中一条带，直接使用特异性识别轻链或者重链的专用二抗即可。这种方法适用于标签抗体，因为标签抗体还是比较便宜的，所以买两个不同种属的标签抗体还是可以接受的。

如果是内源性蛋白，要买两个不同种属的抗体可能比较贵。那么要么用特异性识别轻链或者重链的专用二抗来避免其中的一条带。要么购买能识别空间构象的IP专用二抗。因为在IP免疫沉淀时加入的抗体，在洗脱后会经过煮蛋白的过程，此时加进入的抗体会产生空间构象的改变。而后面WB加入的抗体因为是正常的结构，所以可以利用这点采取识别两种不同构象的二抗。但这种二抗实际使用效果可能并不是很好，有些反映还是会有IGG条带。虽然条带可能会变淡，目的条带也有可能变淡。