蛋白稳定性分析仪PSA-16助力H9N2流感病毒通用疫苗研究
2025-08-31 来源:本站 点击次数:185
蛋白稳定性分析仪PSA-16助力H9N2流感病毒通用疫苗研究
蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力中国科学院武汉病毒研究所科研人员成功开发出一种针对H9N2流感病毒的表位优化型纳米颗粒疫苗，并于2025年6月队在《ACS Nano》期刊发表了题为“Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus”的研究论文。
Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus
Mengchan Hao, Yanhai Wang, Wenxue Yang, Meng Xu, Yiwei Guan, Yuan Zhang, JianJun Chen
PMID: 40452158 DOI: 10.1021/acsnano.5c03199
摘要
H9N2禽流感病毒（AIV）对全球家禽业构成日益严重的威胁，并持续存在感染人类的风险。疫苗接种是预防和控制H9N2 AIV的关键策略。然而，病毒的持续进化不断挑战免疫保护的效率。因此，开发一种能够引发广谱免疫反应的通用H9N2流感疫苗对于疫情防控至关重要。本研究报道了一种表位优化的纳米颗粒（NPs）疫苗，该疫苗能够引发针对H9N2流感病毒的广泛交叉反应性免疫。利用计算算法Epigraph，我们首先设计了三个具有优化表位的H9血凝素（HA1）球状头部。随后，每个抗原与mi3 NPs结合，并将这三种构建体以等摩尔比例混合，生成Epigraph疫苗。我们将Epigraph疫苗与目前推荐的候选疫苗病毒（CVV）AL/39进行了比较。Epigraph疫苗在小鼠中有效诱导了交叉反应性抗体，并激活了CD4+和CD8+ T细胞免疫反应。此外，该疫苗对多种H9N2毒株的致死性攻击提供了有效保护，并显著降低了小鼠肺部的病毒载量。本研究为应对未来H9N2疫情提供了一种有前景的通用疫苗候选方案。
介绍
H9N2亚型禽流感病毒（AIV）于1966年首次从美国威斯康星州的火鸡中分离，现已在欧亚大陆、中东和非洲国家的多种家禽中形成地方性流行，对全球家禽业造成严重经济损失，并在哺乳动物和人类中引发零星感染。自1994年在中国首次分离以来，经过20多年的传播与进化，H9N2已取代H7N9和H5N6病毒，成为中国禽类中的主要AIV亚型。目前，H9N2无需适应性突变即可直接感染人类，引发不同程度的呼吸道疾病。自1998年首次报告人类感染H9N2病例以来，2014年至2016年间，中国部分省份职业暴露人群的H9N2 AIV血清阳性率已达11.20%，表明禽类从业人员感染H9N2的风险显著增加。
此外，自2020年以来，人类感染H9N2的病例数量显著上升。截至目前，已有超过150人感染H9N2 AIV。系统发育分析表明，H9N2病毒是人类H5N1、H7N9、H3N8和H10N8病毒内部基因的供体，凸显了其在新型流感病毒株出现中的关键作用。
近期研究表明，大多数H9N2病毒已获得与人类型受体（α2,6唾液酸）结合的能力，这凸显了采取有效措施预防和控制H9N2传播的紧迫性。开发针对潜在大流行亚型的疫苗是大流行防控的关键策略。迄今为止，已开发出多种H9N2候选疫苗。然而，中国的H9N2病毒经历了广泛的基因重配，导致新基因型的不断出现。这种持续的抗原变异显著促进了病毒在免疫禽类中的传播。尽管市售H9N2疫苗对匹配抗原的毒株普遍有效，但其对不匹配抗原毒株的保护效力有限。例如，1997年至2002年间分离的大多数H9N2禽流感病毒与代表性疫苗株SD/6/96相比，表现出抗原漂移。疫苗株与流行株之间的不匹配使得有效控制H9N2禽流感病毒的传播更加复杂，凸显了改进疫苗技术并产生针对多种H9N2流感病毒的广泛交叉免疫的迫切需求。
Epigraph是一种高效的基于图的算法，通过最大化所有潜在9聚体T细胞表位的覆盖范围来设计疫苗抗原。该算法已应用于开发治疗性HIV疫苗候选物和泛丝状病毒疫苗候选物。在小鼠和猪模型中，使用Epigraph算法设计的流感病毒候选疫苗表现出优于市售全灭活四价猪流感疫苗的交叉免疫反应。使用Epigraph算法设计的腺病毒载体疫苗已显示出对猪H3亚型流感病毒的强保护性免疫反应。此外，计算设计的多价Epigraph血凝素疫苗在小鼠模型中表现出对乙型流感病毒的保护效力。该算法能够高效计算设计单抗原或多抗原疫苗，最大化不同病原体群体的潜在表位覆盖范围，并适用于包括疫苗开发在内的抗原设计项目。
血凝素（HA）蛋白是流感病毒表面暴露的糖蛋白，是自然和疫苗介导的甲型流感病毒免疫中最具免疫原性的靶点。HA通过结合细胞表面受体并诱导膜融合启动感染，同时也是抗流感药物的主要靶点。位于HA蛋白球状头部的受体结合域已被确定为疫苗接种后引发有效中和抗体的关键。尽管在开发基于HA的疫苗方面做出了诸多努力，但亚单位疫苗的低免疫原性仍然是一个限制因素。为克服这一限制，已使用多种类型的纳米颗粒（NPs）通过多价抗原呈递增强流感亚单位疫苗的免疫原性，包括病毒样颗粒（VLPs）、噬菌体、多糖和病毒体。例如，计算设计并优化的突变体i3−01（mi3）已被用作纳米级支架以增强抗原免疫原性。
抗原与纳米颗粒的偶联可通过自发连接的SpyTag-SpyCatcher蛋白质共价键合策略实现。该系统展现出显著的连接效率和稳定性。在本研究中，我们将三个表位优化的HA1蛋白通过SpyTag共价连接到经SpyCatcher修饰的纳米颗粒上，使目标蛋白能够轻松附着于纳米颗粒表面。通过将三种纳米颗粒混合，我们设计了一种Epigraph疫苗候选物。动物实验表明，该Epigraph疫苗能够诱导高效且广泛的体液和细胞免疫反应，并对不同H9N2禽流感病毒株的致死性攻击提供充分保护。本研究支持Epigraph疫苗作为通用型H9N2流感疫苗的潜在候选物。
结果
H9表位抗原的设计与开发
H9表位抗原是使用Epigraph疫苗在线设计工具https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html进行设计的，该工具采用了一种高效的基于图的算法，通过将每个连续的抗原表位长度片段（即每个k-mer）视为潜在抗原表位，从而最大化病原体群体的潜在表位覆盖范围。通常，k=9被设定为潜在T细胞表位（PTE）的长度，因为这是大多数细胞毒性T细胞I类表位的最佳长度。在抗原设计之前，我们从GISAID下载了截至2022年11月的所有可用H9N2 HA1序列。设计过程首先将数据集中的每个序列分解为所有可能的9-mer，并计算每个9-mer在样本群体中的频率值（覆盖分数）。随后，该算法从具有最高覆盖分数的短序列（9-mer）中组装出一组代表性蛋白序列（Epigraph0），确保该序列包含目标病毒群体中最常见的潜在9-mer表位。对于单价疫苗，单一抗原已足够。然而，为了进一步提高覆盖范围，该算法去除由Epigraph0覆盖的表位，并生成第二个互补序列（Epigraph1）。此过程重复进行以生成第三个互补序列（Epigraph2）。Epigraph0代表最优的单一抗原，Epigraph1是最佳互补抗原，依此类推。虽然增加Epigraph序列的数量可以提高群体覆盖范围，但随着越来越罕见的表位被纳入，收益逐渐递减。最终的三价Epigraph免疫原（由Epigraph0、Epigraph1和Epigraph2抗原混合而成）为群体中的潜在线性表位提供了最优覆盖。
为了可视化三个Epigraph序列与整个群体之间的关系，我们使用MAFFT将序列与来自流感研究数据库的6,445个独特H9 HA1蛋白序列进行比对，并构建了最大似然（ML）系统发育树（图1A）。通过BLAST比对，我们在数据库中识别出最相似的野生型序列如下：Epigraph0-A/鸡/北京/XY1125/2014（序列一致性：99.7%），Epigraph1-A/鸡/安徽/A3176/2014（序列一致性：90.21%），以及Epigraph2-A/鸡/大阪/aq69/2001（序列一致性：90%）。为了评估Epigraph疫苗的效力，我们将其与当前推荐的候选疫苗病毒（CVV）A/安徽-庐江/39/2018（AL/39，2018年的人类分离株）进行了比较，该疫苗是世界卫生组织（WHO）于2018年推荐的候选灭活疫苗。
Production and Characterization of H9 Epigraph-mi3NPs
TH9 Epigraph-mi3纳米颗粒的制备与表征。纳米颗粒的尺寸对于激发免疫反应至关重要，其必须与病原体尺寸相当，才能被免疫细胞有效识别。因此，它们可作为载体，将抗原高效递送至抗原呈递细胞（APC），并诱导最佳的免疫激活反应。本研究采用mi3纳米颗粒作为抗原展示的纳米级支架，以提升免疫系统的激活效率。该支架是一种自组装的多孔十二面体结构，由60个相同亚基构成，作为多聚化纳米颗粒平台，为免疫原性较弱的抗原提供安全且具有免疫原性的疫苗接种系统。
如先前所述，SpyTag是一种13个氨基酸的肽段，可在短时间内与其蛋白伴侣SpyCatcher（92个氨基酸）形成共价键（图1B）。SpyCatcher/SpyTag系统因其简便性、快速性及实现体外蛋白质自组装的能力而被广泛应用于蛋白质偶联。因此，我们将SpyCatcher融合至mi3的N端（图1C）。如图1D、E所示，SpyCatcher-mi3在大肠杆菌细胞质中可溶且高效表达，并通过镍柱亲和层析及尺寸排阻色谱（SEC）进行纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析显示，SpyCatcher-mi3纳米颗粒呈现单一清晰条带，SEC色谱图中观察到单一主峰，表明其结构均一且纯度较高。负染透射电子显微镜（TEM）显示，SpyCatcher-mi3组装成预期的十二面体球形颗粒，直径约为26 nm，略小于动态光散射（DLS）测得的流体力学直径（图1F、G）。为评估mi3纳米颗粒的稳定性，我们进行了SDS-PAGE分析。将mi3纳米颗粒在37、25、4及−80 °C下孵育1周，以评估其潜在降解情况。结果表明，mi3纳米颗粒在所有测试温度下均保持高度稳定（图S1A），符合疫苗生产中纳米颗粒支架的标准。
我们将SpyTag融合至密码子优化的Epigraph HA基因的C端，将其克隆至pCAGGS载体中，并瞬时转染HEK293F细胞，获得Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag及Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析显示，三种Epigraph抗原均呈现单一清晰条带，表明抗原纯度较高（图1D）。稳定性实验表明，Epigraph抗原在37、25、4及−80 °C下孵育1周后仍保持稳定（图S1A）。
我们将SpyTag融合到密码子优化的Epigraph HA基因的C端，将其克隆到pCAGGS载体中，并通过瞬时转染HEK293F细胞获得了Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag和Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析显示，所有三种Epigraph抗原均呈现单一清晰的条带，表明抗原纯度较高（图1D）。稳定性实验表明，Epigraph抗原在37°C、25°C、4°C和−80°C下孵育1周后仍保持稳定（图S1A）。
为制备Epigraph-mi3纳米颗粒（NPs），我们首先评估了SpyCatcher-mi3与Epigraph-SpyTag在不同比例下的结合效率。结果显示，随着Epigraph-SpyTag量的增加，残留的SpyCatcher-mi3逐渐减少。值得注意的是，当SpyCatcher-mi3与Epigraph-SpyTag的摩尔比达到1:4时，SpyCatcher-mi3的减少不再明显，表明支架已达到饱和且存在过量的未结合Epigraph-SpyTag（图S2）。基于这些发现，我们将15 μM的SpyCatcher-mi3与60 μM的Epigraph-SpyTag（mi3 NPs支架与Epigraph抗原的比例为1:4）在4°C下孵育过夜进行体外结合反应，随后通过SEC纯化去除未反应的Epigraph抗原和未结合的mi3 NPs。图1D中的SDS-PAGE结果显示，结合产物Epigraph-mi3呈现单一清晰的条带，明显大于Epigraph抗原和mi3，证实Epigraph抗原已有效结合到mi3 NPs上。这一结果在SEC色谱图中Epigraph-mi3 NPs峰的前移中得到了进一步验证（图1E）。负染TEM显示，mi3 NPs呈现规则形状的球形颗粒，而Epigraph0-mi3 NPs表面模糊，可见明显的突出蛋白，且直径大于mi3 NPs。图1F中Epigraph1-mi3和Epigraph2-mi3 NPs也观察到类似结果。DLS分析证实了颗粒尺寸分布，Epigraph-mi3 NPs的流体动力学直径大于未结合的mi3 NPs（图1G）。
此外，所有 Epigraph-mi3 纳米颗粒的多分散性指数（PDI）值均低于 0.5，表明 Epigraph-mi3 纳米颗粒具有均匀的尺寸分布（表 S1）。
为了探究将 Epigraph 抗原偶联到 mi3 纳米颗粒上是否会影响其热稳定性，我们将 Epigraph-mi3 纳米颗粒分别在 37、25、4 和 -80 °C 下孵育 1 周。结果表明，在 -80 至 25 °C 的测试温度范围内，Epigraph-mi3 纳米颗粒未出现显著降解（图 S1A）。差示扫描荧光法（DSF）结果显示，Epigraph-mi3 纳米颗粒和相应的 Epigraph 抗原表现出相似的热稳定性，具有几乎相同的 Tm 值，这表明 Epigraph 抗原与 mi3 蛋白的融合对其结构稳定性没有显著影响（图 S1B）。由于大多数疫苗建议在冷藏条件下（2 - 8 °C）储存，本研究构建的纳米颗粒疫苗在常规疫苗储存条件下保持了一定程度的热稳定性。
讨论
我们采用T细胞表位优化技术和基于纳米颗粒的递送系统，成功开发了Epigraph疫苗。该疫苗在小鼠模型中引发了广谱抗体反应和强烈的细胞免疫反应，对多种H9N2毒株的致死性攻击提供了有效保护。这些研究结果表明，Epigraph疫苗作为通用H9N2疫苗的候选者具有显著潜力，对H9N2病毒的控制具有重要影响。
材料和方法
差示扫描荧光法（DSF）
使用PSA-16仪器（北京佰司特科技）评估目标蛋白的热稳定性。样品稀释至约1 mg/mL，取20 μL稀释样品上样至石英玻璃管（Cat# LG-002，京佰司特科技）。按照制造商说明进行操作。简而言之，以1°C/min的升温速率从30°C线性扫描至100°C，并在330 nm和350 nm波长下测量蛋白荧光强度。热转变中点（Tm）由F350/F330荧光比曲线的斜率确定。每个样品测量三次。使用GraphPad Prism 9软件绘制一阶导数数据。
蛋白稳定性分析仪PSA-16
北京佰司特科技有限责任公司于2023年推出了自主研发的第一款国产的蛋白稳定性分析仪PSA-16。
PSA-16的性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性研究分析领域的空白。
主要参数
★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；
★ 样品通量：16个；
★ 样品体积：≤20 uL；
★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；
★ 温控范围：15-110度；
★ 变温速度：0.1-15度/分钟；
★ Tm重复性：CV小于1%；
★ 耗材参数：一次性，无需清洗；
★ 八联排设计，适配多通道移液器；
蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。
PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。
蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。
1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选
2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等
3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗体偶联药物（ADC）研究
5. 多结构域去折叠特性研究
6. 物理和化学条件强制降解研究
7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）
8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白纯化条件快速优化等
北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)
类器官串联芯片培养仪—HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪—IMOLA；光片显微镜—LSM-200；
蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子质量光度系统—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；
全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；台式原子力显微镜—ACST-AFM；微纳加工点印仪—NLP2000DPN5000；
蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力中国科学院武汉病毒研究所科研人员成功开发出一种针对H9N2流感病毒的表位优化型纳米颗粒疫苗，并于2025年6月队在《ACS Nano》期刊发表了题为“Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus”的研究论文。
Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H9N2 Influenza Virus
Mengchan Hao, Yanhai Wang, Wenxue Yang, Meng Xu, Yiwei Guan, Yuan Zhang, JianJun Chen
PMID: 40452158 DOI: 10.1021/acsnano.5c03199
摘要
H9N2禽流感病毒（AIV）对全球家禽业构成日益严重的威胁，并持续存在感染人类的风险。疫苗接种是预防和控制H9N2 AIV的关键策略。然而，病毒的持续进化不断挑战免疫保护的效率。因此，开发一种能够引发广谱免疫反应的通用H9N2流感疫苗对于疫情防控至关重要。本研究报道了一种表位优化的纳米颗粒（NPs）疫苗，该疫苗能够引发针对H9N2流感病毒的广泛交叉反应性免疫。利用计算算法Epigraph，我们首先设计了三个具有优化表位的H9血凝素（HA1）球状头部。随后，每个抗原与mi3 NPs结合，并将这三种构建体以等摩尔比例混合，生成Epigraph疫苗。我们将Epigraph疫苗与目前推荐的候选疫苗病毒（CVV）AL/39进行了比较。Epigraph疫苗在小鼠中有效诱导了交叉反应性抗体，并激活了CD4+和CD8+ T细胞免疫反应。此外，该疫苗对多种H9N2毒株的致死性攻击提供了有效保护，并显著降低了小鼠肺部的病毒载量。本研究为应对未来H9N2疫情提供了一种有前景的通用疫苗候选方案。
介绍
H9N2亚型禽流感病毒（AIV）于1966年首次从美国威斯康星州的火鸡中分离，现已在欧亚大陆、中东和非洲国家的多种家禽中形成地方性流行，对全球家禽业造成严重经济损失，并在哺乳动物和人类中引发零星感染。自1994年在中国首次分离以来，经过20多年的传播与进化，H9N2已取代H7N9和H5N6病毒，成为中国禽类中的主要AIV亚型。目前，H9N2无需适应性突变即可直接感染人类，引发不同程度的呼吸道疾病。自1998年首次报告人类感染H9N2病例以来，2014年至2016年间，中国部分省份职业暴露人群的H9N2 AIV血清阳性率已达11.20%，表明禽类从业人员感染H9N2的风险显著增加。
此外，自2020年以来，人类感染H9N2的病例数量显著上升。截至目前，已有超过150人感染H9N2 AIV。系统发育分析表明，H9N2病毒是人类H5N1、H7N9、H3N8和H10N8病毒内部基因的供体，凸显了其在新型流感病毒株出现中的关键作用。
近期研究表明，大多数H9N2病毒已获得与人类型受体（α2,6唾液酸）结合的能力，这凸显了采取有效措施预防和控制H9N2传播的紧迫性。开发针对潜在大流行亚型的疫苗是大流行防控的关键策略。迄今为止，已开发出多种H9N2候选疫苗。然而，中国的H9N2病毒经历了广泛的基因重配，导致新基因型的不断出现。这种持续的抗原变异显著促进了病毒在免疫禽类中的传播。尽管市售H9N2疫苗对匹配抗原的毒株普遍有效，但其对不匹配抗原毒株的保护效力有限。例如，1997年至2002年间分离的大多数H9N2禽流感病毒与代表性疫苗株SD/6/96相比，表现出抗原漂移。疫苗株与流行株之间的不匹配使得有效控制H9N2禽流感病毒的传播更加复杂，凸显了改进疫苗技术并产生针对多种H9N2流感病毒的广泛交叉免疫的迫切需求。
Epigraph是一种高效的基于图的算法，通过最大化所有潜在9聚体T细胞表位的覆盖范围来设计疫苗抗原。该算法已应用于开发治疗性HIV疫苗候选物和泛丝状病毒疫苗候选物。在小鼠和猪模型中，使用Epigraph算法设计的流感病毒候选疫苗表现出优于市售全灭活四价猪流感疫苗的交叉免疫反应。使用Epigraph算法设计的腺病毒载体疫苗已显示出对猪H3亚型流感病毒的强保护性免疫反应。此外，计算设计的多价Epigraph血凝素疫苗在小鼠模型中表现出对乙型流感病毒的保护效力。该算法能够高效计算设计单抗原或多抗原疫苗，最大化不同病原体群体的潜在表位覆盖范围，并适用于包括疫苗开发在内的抗原设计项目。
血凝素（HA）蛋白是流感病毒表面暴露的糖蛋白，是自然和疫苗介导的甲型流感病毒免疫中最具免疫原性的靶点。HA通过结合细胞表面受体并诱导膜融合启动感染，同时也是抗流感药物的主要靶点。位于HA蛋白球状头部的受体结合域已被确定为疫苗接种后引发有效中和抗体的关键。尽管在开发基于HA的疫苗方面做出了诸多努力，但亚单位疫苗的低免疫原性仍然是一个限制因素。为克服这一限制，已使用多种类型的纳米颗粒（NPs）通过多价抗原呈递增强流感亚单位疫苗的免疫原性，包括病毒样颗粒（VLPs）、噬菌体、多糖和病毒体。例如，计算设计并优化的突变体i3−01（mi3）已被用作纳米级支架以增强抗原免疫原性。
抗原与纳米颗粒的偶联可通过自发连接的SpyTag-SpyCatcher蛋白质共价键合策略实现。该系统展现出显著的连接效率和稳定性。在本研究中，我们将三个表位优化的HA1蛋白通过SpyTag共价连接到经SpyCatcher修饰的纳米颗粒上，使目标蛋白能够轻松附着于纳米颗粒表面。通过将三种纳米颗粒混合，我们设计了一种Epigraph疫苗候选物。动物实验表明，该Epigraph疫苗能够诱导高效且广泛的体液和细胞免疫反应，并对不同H9N2禽流感病毒株的致死性攻击提供充分保护。本研究支持Epigraph疫苗作为通用型H9N2流感疫苗的潜在候选物。
结果
H9表位抗原的设计与开发
H9表位抗原是使用Epigraph疫苗在线设计工具https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html进行设计的，该工具采用了一种高效的基于图的算法，通过将每个连续的抗原表位长度片段（即每个k-mer）视为潜在抗原表位，从而最大化病原体群体的潜在表位覆盖范围。通常，k=9被设定为潜在T细胞表位（PTE）的长度，因为这是大多数细胞毒性T细胞I类表位的最佳长度。在抗原设计之前，我们从GISAID下载了截至2022年11月的所有可用H9N2 HA1序列。设计过程首先将数据集中的每个序列分解为所有可能的9-mer，并计算每个9-mer在样本群体中的频率值（覆盖分数）。随后，该算法从具有最高覆盖分数的短序列（9-mer）中组装出一组代表性蛋白序列（Epigraph0），确保该序列包含目标病毒群体中最常见的潜在9-mer表位。对于单价疫苗，单一抗原已足够。然而，为了进一步提高覆盖范围，该算法去除由Epigraph0覆盖的表位，并生成第二个互补序列（Epigraph1）。此过程重复进行以生成第三个互补序列（Epigraph2）。Epigraph0代表最优的单一抗原，Epigraph1是最佳互补抗原，依此类推。虽然增加Epigraph序列的数量可以提高群体覆盖范围，但随着越来越罕见的表位被纳入，收益逐渐递减。最终的三价Epigraph免疫原（由Epigraph0、Epigraph1和Epigraph2抗原混合而成）为群体中的潜在线性表位提供了最优覆盖。
为了可视化三个Epigraph序列与整个群体之间的关系，我们使用MAFFT将序列与来自流感研究数据库的6,445个独特H9 HA1蛋白序列进行比对，并构建了最大似然（ML）系统发育树（图1A）。通过BLAST比对，我们在数据库中识别出最相似的野生型序列如下：Epigraph0-A/鸡/北京/XY1125/2014（序列一致性：99.7%），Epigraph1-A/鸡/安徽/A3176/2014（序列一致性：90.21%），以及Epigraph2-A/鸡/大阪/aq69/2001（序列一致性：90%）。为了评估Epigraph疫苗的效力，我们将其与当前推荐的候选疫苗病毒（CVV）A/安徽-庐江/39/2018（AL/39，2018年的人类分离株）进行了比较，该疫苗是世界卫生组织（WHO）于2018年推荐的候选灭活疫苗。
Production and Characterization of H9 Epigraph-mi3NPs
TH9 Epigraph-mi3纳米颗粒的制备与表征。纳米颗粒的尺寸对于激发免疫反应至关重要，其必须与病原体尺寸相当，才能被免疫细胞有效识别。因此，它们可作为载体，将抗原高效递送至抗原呈递细胞（APC），并诱导最佳的免疫激活反应。本研究采用mi3纳米颗粒作为抗原展示的纳米级支架，以提升免疫系统的激活效率。该支架是一种自组装的多孔十二面体结构，由60个相同亚基构成，作为多聚化纳米颗粒平台，为免疫原性较弱的抗原提供安全且具有免疫原性的疫苗接种系统。
如先前所述，SpyTag是一种13个氨基酸的肽段，可在短时间内与其蛋白伴侣SpyCatcher（92个氨基酸）形成共价键（图1B）。SpyCatcher/SpyTag系统因其简便性、快速性及实现体外蛋白质自组装的能力而被广泛应用于蛋白质偶联。因此，我们将SpyCatcher融合至mi3的N端（图1C）。如图1D、E所示，SpyCatcher-mi3在大肠杆菌细胞质中可溶且高效表达，并通过镍柱亲和层析及尺寸排阻色谱（SEC）进行纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析显示，SpyCatcher-mi3纳米颗粒呈现单一清晰条带，SEC色谱图中观察到单一主峰，表明其结构均一且纯度较高。负染透射电子显微镜（TEM）显示，SpyCatcher-mi3组装成预期的十二面体球形颗粒，直径约为26 nm，略小于动态光散射（DLS）测得的流体力学直径（图1F、G）。为评估mi3纳米颗粒的稳定性，我们进行了SDS-PAGE分析。将mi3纳米颗粒在37、25、4及−80 °C下孵育1周，以评估其潜在降解情况。结果表明，mi3纳米颗粒在所有测试温度下均保持高度稳定（图S1A），符合疫苗生产中纳米颗粒支架的标准。
我们将SpyTag融合至密码子优化的Epigraph HA基因的C端，将其克隆至pCAGGS载体中，并瞬时转染HEK293F细胞，获得Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag及Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析显示，三种Epigraph抗原均呈现单一清晰条带，表明抗原纯度较高（图1D）。稳定性实验表明，Epigraph抗原在37、25、4及−80 °C下孵育1周后仍保持稳定（图S1A）。
我们将SpyTag融合到密码子优化的Epigraph HA基因的C端，将其克隆到pCAGGS载体中，并通过瞬时转染HEK293F细胞获得了Epigraph0-SpyTag、Epigraph1-SpyTag和Epigraph2-SpyTag抗原。SDS-PAGE分析显示，所有三种Epigraph抗原均呈现单一清晰的条带，表明抗原纯度较高（图1D）。稳定性实验表明，Epigraph抗原在37°C、25°C、4°C和−80°C下孵育1周后仍保持稳定（图S1A）。
为制备Epigraph-mi3纳米颗粒（NPs），我们首先评估了SpyCatcher-mi3与Epigraph-SpyTag在不同比例下的结合效率。结果显示，随着Epigraph-SpyTag量的增加，残留的SpyCatcher-mi3逐渐减少。值得注意的是，当SpyCatcher-mi3与Epigraph-SpyTag的摩尔比达到1:4时，SpyCatcher-mi3的减少不再明显，表明支架已达到饱和且存在过量的未结合Epigraph-SpyTag（图S2）。基于这些发现，我们将15 μM的SpyCatcher-mi3与60 μM的Epigraph-SpyTag（mi3 NPs支架与Epigraph抗原的比例为1:4）在4°C下孵育过夜进行体外结合反应，随后通过SEC纯化去除未反应的Epigraph抗原和未结合的mi3 NPs。图1D中的SDS-PAGE结果显示，结合产物Epigraph-mi3呈现单一清晰的条带，明显大于Epigraph抗原和mi3，证实Epigraph抗原已有效结合到mi3 NPs上。这一结果在SEC色谱图中Epigraph-mi3 NPs峰的前移中得到了进一步验证（图1E）。负染TEM显示，mi3 NPs呈现规则形状的球形颗粒，而Epigraph0-mi3 NPs表面模糊，可见明显的突出蛋白，且直径大于mi3 NPs。图1F中Epigraph1-mi3和Epigraph2-mi3 NPs也观察到类似结果。DLS分析证实了颗粒尺寸分布，Epigraph-mi3 NPs的流体动力学直径大于未结合的mi3 NPs（图1G）。
此外，所有 Epigraph-mi3 纳米颗粒的多分散性指数（PDI）值均低于 0.5，表明 Epigraph-mi3 纳米颗粒具有均匀的尺寸分布（表 S1）。
为了探究将 Epigraph 抗原偶联到 mi3 纳米颗粒上是否会影响其热稳定性，我们将 Epigraph-mi3 纳米颗粒分别在 37、25、4 和 -80 °C 下孵育 1 周。结果表明，在 -80 至 25 °C 的测试温度范围内，Epigraph-mi3 纳米颗粒未出现显著降解（图 S1A）。差示扫描荧光法（DSF）结果显示，Epigraph-mi3 纳米颗粒和相应的 Epigraph 抗原表现出相似的热稳定性，具有几乎相同的 Tm 值，这表明 Epigraph 抗原与 mi3 蛋白的融合对其结构稳定性没有显著影响（图 S1B）。由于大多数疫苗建议在冷藏条件下（2 - 8 °C）储存，本研究构建的纳米颗粒疫苗在常规疫苗储存条件下保持了一定程度的热稳定性。
讨论
我们采用T细胞表位优化技术和基于纳米颗粒的递送系统，成功开发了Epigraph疫苗。该疫苗在小鼠模型中引发了广谱抗体反应和强烈的细胞免疫反应，对多种H9N2毒株的致死性攻击提供了有效保护。这些研究结果表明，Epigraph疫苗作为通用H9N2疫苗的候选者具有显著潜力，对H9N2病毒的控制具有重要影响。
材料和方法
差示扫描荧光法（DSF）
使用PSA-16仪器（北京佰司特科技）评估目标蛋白的热稳定性。样品稀释至约1 mg/mL，取20 μL稀释样品上样至石英玻璃管（Cat# LG-002，京佰司特科技）。按照制造商说明进行操作。简而言之，以1°C/min的升温速率从30°C线性扫描至100°C，并在330 nm和350 nm波长下测量蛋白荧光强度。热转变中点（Tm）由F350/F330荧光比曲线的斜率确定。每个样品测量三次。使用GraphPad Prism 9软件绘制一阶导数数据。
蛋白稳定性分析仪PSA-16
北京佰司特科技有限责任公司于2023年推出了自主研发的第一款国产的蛋白稳定性分析仪PSA-16。
PSA-16的性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性研究分析领域的空白。
主要参数
★ 测定参数：Tm、Cm、ΔG等；
★ 样品通量：16个；
★ 样品体积：≤20 uL；
★ 浓度范围：0.01-200 mg/ml；
★ 温控范围：15-110度；
★ 变温速度：0.1-15度/分钟；
★ Tm重复性：CV小于1%；
★ 耗材参数：一次性，无需清洗；
★ 八联排设计，适配多通道移液器；
蛋白稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。
PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。
蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。
1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选
2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等
3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗体偶联药物（ADC）研究
5. 多结构域去折叠特性研究
6. 物理和化学条件强制降解研究
7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）
8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白纯化条件快速优化等
北京佰司特科技有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)
类器官串联芯片培养仪—HUMIMIC；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪—IMOLA；光片显微镜—LSM-200；
蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子质量光度系统—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；
全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；台式原子力显微镜—ACST-AFM；微纳加工点印仪—NLP2000DPN5000；
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