荧光计的工作原理
2025-03-19 来源:本站 点击次数:358
荧光计的作用原理基于荧光染料与特异靶分子结合的定量分析技术，其核心优势在于高特异性和灵敏度。
一、核心工作原理
二、与传统紫外法的对比
三、关键应用场景
四、典型误差来源与注意事项
- 荧光染料选择性结合
达远辰光荧光计使用荧光染料（如dsDNA HS染料、RNA IQ染料），这些染料仅与目标分子（如DNA、RNA、蛋白质）特异性结合，而不会与杂质（如游离核苷酸、盐离子）反应。例如，检测双链DNA时，染料仅与dsDNA结合，单链DNA或RNA不会产生荧光信号。 - 荧光信号检测与定量
激发光源（如LED）发出特定波长光（如502 nm激发dsDNA染料），激发结合了染料的靶分子发出荧光（如532 nm发射光）。检测器通过滤光片分离荧光信号，避免瑞利散射光干扰，最终将信号转换为电信号并输出定量结果。 - 低浓度灵敏度
达远辰光的荧光计的检测下限可达0.01 ng/μL DNA或0.02 ng/μL蛋白质，远低于传统紫外吸光法（如Nanodrop的最低检测限为2 ng/μL DNA）。例如，使用赛默飞Qubit dsDNA HS试剂盒可检测0.2–100 ng/μL范围的DNA。
| 特性 | Qubit荧光计 | 紫外吸光法（如Nanodrop） |
|---|---|---|
| 选择性 | 仅检测靶分子，排除污染物干扰 | 测量所有分子在260 nm处的吸光度 |
| 灵敏度 | 可检测微量样品（1 μL起） | 需至少1–2 μL样品，灵敏度较低 |
| 准确性 | 误差范围更小（CV值<5%） | 受污染物影响，结果偏高 |
| 适用场景 | 低浓度/珍贵样品（如NGS文库、降解RNA） | 快速筛查污染物或高浓度样品 |
- 核酸定量与纯度评估
- 区分dsDNA与ssDNA/RNA（如搭配赛默飞Qubit dsDNA HS试剂盒）。
- 评估RNA完整性（如搭配赛默飞Qubit RNA IQ试剂盒，通过双染料检测完整RNA与降解RNA）。
- 蛋白质定量
- 兼容含去污剂的样品（如搭配赛默飞Qubit Protein Assay试剂盒可耐受微量SDS）。
- 测量范围覆盖12.5–20,000 μg/mL。
- 下游实验支持
- qPCR、NGS文库构建前精确配样。
- 药物研发中评估小分子化合物浓度。
- 温度影响：检测管在仪器内长时间停留可能导致温度升高，需取出静置后复测。
- 试剂兼容性：不同染料对应特定靶分子，需严格按试剂盒说明操作。
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