单独孵育DdmD与DdmE无法形成稳定复合物，但加入双叉DNA底物后，两者可组装为稳定的三元复合物。EMSA实验显示，ATP的加入显著促进DdmD单体-DNA复合物的生成，提示ATP可能参与二聚体的解离过程。

冷冻电镜结构显示，一个DdmE单体连接一个DdmD二聚体，形成不对称三元复合物。DNA底物呈现三链结构：引导DNA（gDNA）、互补靶DNA（ctDNA）和非互补靶DNA（nctDNA）。DdmE以引导依赖的方式结合ctDNA，形成部分D-loop。这一结果表明，DNA底物是DdmE与DdmD组装的关键，DdmE在其中承担靶向与招募的双重角色。

3 DdmE是一个DNA引导的DNA靶向模块

图3：DdmE招募DdmD的结构基础

(A-B) DdmE具有N、L1、PAZ、L2、MID和PIWI样结构域，PIWI中插入一个全新折叠的DID域；
(C-D) DID由四个α螺旋组成发夹状结构；
(E-G) DdmD通过HD2和Arch结构域与DdmE的DID及L1-PAZ-L2结合，关键盐桥为D609-K523和R604-E568；
(H) 破坏该界面的突变体丧失质粒清除能力。

DdmE具有典型的Argonaute折叠，其PIWI样结构域中插入了一个此前未知的DID（DdmDE相互作用域）。DID由四个α螺旋构成发夹状结构，在PDB中无同源结构。该域与L1-PAZ-L2共同形成一个口袋，容纳DdmD的HD2螺旋发夹。两者界面约800 Ų，主要由氢键和盐桥维持，包括D609-K523和R604-E568两对关键盐桥。

体内实验证实，上述界面残基突变后，DdmDE丧失质粒清除能力，细菌恢复正常生长，表明DdmD-DdmE的直接相互作用是防御功能所必需的。

4 引导DNA的识别特征

图5：DdmD识别ssDNA

(A-C) ssDNA以5‘→3’方向穿过HD1和HD2形成的正电荷通道；
(D-E) HD1协调4个碱基，HD2协调5个碱基，G1-A2-G3呈翻转构象，G3处发生扭结；
(F) 相互作用主要通过磷酸二酯骨架和亲水残基介导；
(G) HD1和HD2各含一个正电荷斑块，可能交替抓取ssDNA

结构比较显示，DNA结合后DdmD两个原体相互倾斜，界面II的关键相互作用显著减弱或消失，二聚体总埋藏面积由约5100 Ų降至约4700 Ų。冷冻电镜分类捕获到部分解离和完全解离两种中间状态：部分解离状态下界面II已完全破坏，界面I仍完整，表明解离分两步进行，界面II先断裂。

EMSA结果表明，3’突出端长于18个核苷酸的双叉DNA可有效触发解离，短于14个核苷酸则不能。ATP可促进解离，提示解旋酶活性与解离过程耦合。低盐条件同样促进解离，与界面II的疏水性质一致。解离后，Arch和IDD中负责二聚化的α螺旋束发生倾斜，为解离提供了结构基础。

6 DdmD单体沿DNA易位并切割

图6：DNA结合触发DdmD解离

(A-B) 比较apo与DNA结合状态，界面II的关键电荷相互作用被破坏；
(C) 冷冻电镜捕获部分解离与完全解离中间态，部分解离时界面II已破坏、界面I完整；
(D-E) 3’突出端长于18 nt的双叉DNA有效触发解离；
(F) 低盐促进解离；
(G-H) 解离后Arch和IDD发生构象变化

解离后的DdmD单体结合单链DNA，并以5‘→3’方向沿DNA易位。结构显示，ssDNA穿过HD1和HD2形成的正电荷通道，HD1协调4个碱基，HD2协调5个碱基，G1、A2、G3呈翻转构象，在G3处发生扭结。ssDNA的3’端鸟嘌呤被Y194通过π-π相互作用终止，限制DNA进一步延伸。

核酸酶活性测试显示，DdmD在锰离子存在下活性最强，镁离子次之，钙、镍、锌离子无活性。E1059A和H1106A突变完全丧失切割活性。DdmD可切割所有含ssDNA片段的底物，但不能切割平末端dsDNA。

7 协同清除质粒的完整通路

图7：DdmDE清除质粒的机制模型

(A) DdmD在Mn²⁺下核酸酶活性最强；
(B) DdmD可切割含ssDNA片段的底物；
(C) DdmDE在ATP存在下高效切割质粒；
(D) gDNA显著增强DdmDE而非DdmD单独的质粒降解活性；
(E) 工作机制：DdmD二聚体先在质粒上产生切口，DdmE-gDNA靶向形成D-loop并招募DdmD二聚体，DNA结合触发解离，单体沿质粒易位切割，切割产物作为新gDNA形成正反馈

将上述发现整合，可得到DdmDE清除质粒的完整工作模型：

第一步，DdmD二聚体产生切口。 静息态DdmD二聚体具有残余核酸酶活性，可将超螺旋质粒转变为开环质粒，为DdmE靶向创造条件。
第二步，DdmE-gDNA定位靶标。 DdmE携带5‘-磷酸化短gDNA，在质粒上识别互补序列，形成D-loop。
第三步，招募DdmD二聚体。 DdmE通过DID结构域招募DdmD二聚体，一个DdmE分子对应一个DdmD二聚体，两个原体可能分别结合ctDNA和nctDNA。
第四步，DNA结合触发解离。 质粒DNA结合导致界面II先断裂，随后界面I断裂，DdmD由二聚体转变为单体。
第五步，ATP驱动易位与切割。 单体DdmD在ATP驱动下以5‘→3’方向沿质粒易位，由核酸酶结构域执行切割。ATP既促进解离，也为易位供能。
第六步，正反馈放大。 DdmD切割产生的ssDNA片段可作为新的gDNA被DdmE利用，形成正反馈循环，实现高效清除。

体外实验支持该模型：DdmD 单独可将超螺旋 pUC19 转为开环形式，对较大的 pBAD 质粒还可产生线性和环状形式；DdmDE 复合物在 ATP 存在下即可将大部分超螺旋质粒转化为线性和环状形式，加入 gDNA 后活性进一步增强（gDNA 仅增强 DdmDE 而非单独 DdmD 的活性）。

8 与 I 型 CRISPR-Cas 系统的机制类比
DdmDE的工作机制与I型CRISPR-Cas系统高度平行。在I型系统中，Cascade（RNA引导）识别靶标并招募Cas3（解旋酶-核酸酶融合蛋白）至非互补链，Cas3切割DNA并沿DNA易位。DdmDE与之对应：DdmE（DNA引导）负责识别与招募，DdmD（解旋酶-核酸酶）负责解离、易位与切割。两者均采用“引导核酸+效应核酸酶”的组织原则，区别在于引导分子类型。

9 gDNA的来源与正反馈
gDNA的可能来源包括：

1. DdmD切割产物：
   DdmD切割质粒产生的小ssDNA片段可直接作为gDNA，构成正反馈循环。
2. 内切酶产生的ssDNA片段：
   细菌内切酶常产生5‘突出端，可供DdmE利用。
3. RecBCD介导的DNA末端切除：
   这解释了DdmDE为何靶向缺乏Chi位点的小型多拷贝质粒。

gDNA的生物发生仍是待解问题，未来可通过体内pull-down结合深度测序进一步阐明。

10 意义与展望
该研究系统阐明了DdmDE系统的组装与激活机制，揭示了一种以DNA引导DNA靶向的细菌防御策略（与同期其它课题组工作相互验证）。从应用角度看，DdmDE的可编程靶向、ATP依赖的易位切割以及正反馈放大特性，使其具备改造为外源DNA传感器、基因组靶向工具和核酸检测工具的潜力。gDNA的生物发生机制及系统的工程化改造，是未来研究的重要方向。

本文中所有荧光标记的PAGE凝胶的成像检测图像均为我公司的 Sapphire 激光扫描成像系统所采集。

原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00822-5

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