关键词：药物筛选；RNA-seq；转录组

药物开发早期筛选的主要目标是识别出能产生预期生物学效应的候选药物，同时淘汰疗效差或毒性不可接受的候选物。通过基因表达和调控分析，科学家能够在早期揭示候选药物对细胞信号传导和表型的影响，从而在进入下游开发阶段前对先导化合物进行有效筛选。

传统RNA建库通常步骤繁琐、试剂消耗较高、吸头等耗材使用量大，且往往依赖Oligo-dT富集，容易丢失非编码RNA信息。然而，长链非编码RNA（lncRNA）越来越被认为是应激、凋亡和其他表型变化的早期标志物。为了打破这一瓶颈，QIAGEN与SPT Labtech联合开发，基于QIAGEN的QIAseq UPXome RNA建库试剂盒与SPT mosquito HV微量移液工作站，推出了一套半自动化和反应体系微缩化的RNA-seq解决方案。

文主要以Caco-2和HEPG2细胞为对象，分别采用传统手动建库与基于QIAGEN UPXome试剂盒的mosquito HV半自动化微缩化建库流程，并对文库比对率、外显子覆盖度、差异表达基因、信号通路富集分析以及整个实验的通量、试剂和耗材消耗等指标进行评估。

一、材料与方法

[ 样本制备 ] 

HEPG2 和 Caco-2 细胞以每孔 35,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中。24 小时后，在无血清 DMEM 中，将细胞和不同浓度的 DMSO（溶剂对照）或 H₂O₂（模拟氧化应激）孵育。24 小时后，用 100 μL 冷 PBS 冲洗细胞，并在 40 μL 1× QIAseq UPX 细胞裂解试剂（13.3 μL 裂解缓冲液、23.3 μL 无核酸酶水、3.3 μL RNase 抑制剂）中裂解。随后，细胞微孔板在室温下振荡孵育 10 分钟，最后冷冻直至进一步处理。

 [ RNA 文库制备 ]

QIAseq FastSelect–rRNA HMR试剂制备，以减少细胞质和线粒体核糖体RNA。逆转录阶段采用oligo-dT引物捕获多聚腺苷酸化转录本，或采用随机六聚体引物实现全转录组覆盖。每个混样池（pooling）包含48个样本，文库使用QIAseq UX索引试剂盒进行扩增和Index。整个工作流程在SPT Labtech mosquito HV微量移液工作站上实现了自动化和微缩化，以减少试剂使用并提高通量。

[ 测序和数据分析 ] 

文库采用短读长RNA-seq进行测序。读段（Reads）比对至人类参考基因组（GRCh38.noalt.106），并使用QIAGEN® CLC Genomics Workbench将其分配至转录本特征区域。针对每种条件计算了比对率、外显子覆盖度及蛋白编码分配情况。差异表达分析采用标准统计过滤条件（绝对倍数变化 > 2，校正p值 < 0.05）。生物学信号通路富集及毒性相关特征分析使用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）完成。

二、实验结果和讨论

1.微缩化体系的验证，比较手动 vs mosquito仪器的数据一致性 

为了验证mosquito微缩化对RNA文库数据质量的影响，本实验使用 0.5 x总反应体系，分别通过手动和mosquito制备了Caco-2 细胞的 RNA文库。随后，在逆转录过程中使用 oligo-dT 引物来富集多聚腺苷酸化 RNA。RNA-seq Mapping比对数据显示，手动和mosquito之间数据比对率相似。以上验证实验表明，基于mosquito文库构建的微缩化和自动化，减少了手工操作时间，且文库和测序数据质量并未受到任何影响（图表1）。

图表1：在0.5 x反应体系下，Coca-2细胞的RNA文库在mosquito和手工条件下的reads对比（percentage of mapped reads）

2.药物处理后的转录组表达分析 

经过氧化氢和二甲基亚砜（DMSO）处理后，处理样本与未处理细胞之间产生了可测量的转录组表达差异。针对不同处理条件下的每个基因，计算了差异表达基因及错误发现率（FDR）（图表2）。正如预期，随着过氧化氢和DMSO剂量的增加，基因表达变化程度随之增大。

图表2：基于IPA分析的Coca-2和HepG2细胞系中，不同DMSO和H₂O₂浓度下FDR<0.05的差异表达基因汇总。

3. 传统方法 vs 基于QIAGEN UPXome技术的微缩化方法在通量和成本上的比较

首先，本文介绍了通过QIAGEN UPXome技术实现了多重分析，该技术在cDNA反应中引入样本标签，从而使cDNA pooling成为可能。将24个样本合并至单个文库，使PCR反应的试剂和枪头耗材用量减少了将近95% （192 vs 9）。随后，利用mosquito HV对试剂进行了1/2的反应体系微缩化，并允许每个文库合并48个样本。与手动文库制备相比，采用QIAGEN UPXome技术，无论是微孔板、枪头和储液槽的用量都更少并兼具经济效益和环境效益。该自动化系统支持96孔、384孔和1536孔微量移液处理，适用于小范围测试性研究和大规模化合物筛选。

图表3：比较了传统RNA-seq试剂盒（手动，1x体系），QIAGEN UPXome技术（手动， 1x体系）和QIAGEN UPXome技术（mosquito，0.5x体系），制备192个样本文库所需的耗材、试剂及时间的比较。

这套基于 SPT mosquito HV 与 QIAGEN 试剂盒的联合方案，为高通量药物筛选转录组分析按下了“加速键”，打通了“自动化 + 微型化 + 直接细胞裂解”的极简路径，实现了三大核心价值：

1. 降本增效：耗材最高节省 98%，试剂用量减半，手工操作时间缩短近 70%，让单样本测序成本大幅下降。

2. 灵活精准：仅需更换逆转录引物，即可在polyA 捕获与全转录组覆盖之间自由切换，rRNA 残留低至 0.1%–0.2%，不错过 lncRNA 等潜在早期生物标志物。

3. 数据可靠：自动化建库比对率达70%–93%，结合 IPA 软件可精准锁定药物毒性通路与上游调控因子。

在创新药研发日益“内卷”的今天，早期筛选的效率直接决定了管线的推进速度。该方案不仅将研究人员从繁琐的移液操作中解放出来，更通过微缩化与超多重混样，让有限的样本和预算发挥出更大的筛选价值。无论是小规模先导化合物验证，还是 96/384/1536 孔板规模的高通量药物筛选，这套“即插即用”的半自动化工作流，都能为药物早期发现提供稳定、灵活且具成本优势的转录组数据支撑，助力更多有潜力的候选分子更快走向临床。

值得留意的是，文中合作的双方——QIAGEN 与 SPT Labtech——如今已同属 EQT 旗下。EQT 是一家全球领先的主动型投资机构，在医疗健康领域布局深厚，当前及过往投资组合中包括超过 210 家医疗健康企业。EQT 牵头的财团已于 2026 年 10 月与QIAGEN达成全现金私有化收购协议，交易预计 2027 年中完成。