在上一期文章中[当D2B遇见mosquito：纳升级精准移液如何让PROTAC“粗品直筛”从构想变为现实?]，我们详细介绍了mosquito如何在1536孔板中助力GSK建立高通量D2B平台，即仅在5 μL的反应体系内完成纳摩尔级的酰胺偶联合成，并直接跳过纯化步骤，将粗提物用于HiBiT细胞降解活性检测。这一应用极大地缩短了PROTACT先导化合物的优化与筛选周期，充分展示了D2B策略在加速药物发现中的巨大潜力。

mosquito构建D2B微量合成和细胞降解实验体系

然而，D2B模式的高效运作，并非凭空而来。其真正的根基，在于早期的一项关键突破——即利用1536孔板实现化合物的微量、高通量合成。正是这项奠基性的技术跃进，使得化学家得以用极微量的珍贵原料，同步探索成百上千种反应条件，从而将药物化学的“设计-合成-纯化-测试 ” 循环从一条低效的串联路径，压缩为极简的“合成 - 测试”模式。以PROTACT筛选为例，在这个过程中，如果没有微量化学合成作为前提，后续基于粗提物的细胞或生化水平的高通量降解检测就无从谈起。

在本期文章中，我们将沿着这条技术演进的脉络，带您回顾D2B在成型之初的关键前提——超微量高通量化学合成，看看它如何为药物化学的范式转变奠定基石。

1.开山鼻祖（2015年 Science）
首次实现1536孔板高通量化学合成 – Merck

2015年，默克团队在《Science》上发表了全球首篇在1536孔板内实现超高通量化合物合成的里程碑式研究。该工作以钯催化的交叉偶联反应为模型，将单个微孔的反应规模压缩至50–100 nmol，每孔仅消耗0.02 mg底物——这一量级既能满足色谱分离和检测的需求，也极大降低了珍贵原料的消耗。

整个反应体系经精心设计，以适配自动化平台的工作流程：在室温下反应，使用DMSO/NMP等高溶解性、低挥发性溶剂，无需搅拌，依靠表面张力和层流效应在1536孔板的微液滴中实现自然混匀。

mosquito在1536孔板中构建微量合成反应体系

在这一流程中，mosquito承担了极其重要的执行角色。它依次吸取催化剂、碱、亲核试剂和底物等4种组分各250 nL，在30分钟内完成6,144次纳升级分配。合成完成后，mosquito再次介入，将粗提物从1536孔板转移至384孔板，用于后续UPLC分析。
这项工作首次证明了：在微孔板中以纳摩尔规模开展高通量化学合成不仅是可行的，而且可以稳定、可重复地运行——它为后续所有D2B（直接生物学）平台的搭建奠定了第一块基石，也开启了药物化学从“毫克级手动操作”迈向“微克级自动化并行探索”的新纪元。

2.条件探索和优化（2018年 Science）
拓展1536孔板高通量合成的反应边界—Merck

如果说2015年的工作证明了“纳摩尔级高通量合成是可行的”，那么2018年默克团队在《Science》上发表的这项研究则回答了下一个关键问题：这种技术能否应用于更广泛的真实化学反应条件？ 答案是肯定的。

在2015年的第一代平台中，反应被严格限定在室温、均相、DMSO/NMP体系内——虽然适合自动化，却只覆盖了现代合成化学工具箱中的一小部分。为了探索更多的反应条件，并系统绘制传统化学反应的“暗空间”——即那些未被文献记录的反应失败规律——研究团队对平台进行了全面的工程升级：

1. 引入玻璃材质的1536孔板，耐受二氧六烷等挥发性有机溶剂；

2. 设计铝制密封加热模块，可在100°C高温下有效防止溶剂挥发；

3. 开发无机碱（Cs₂CO₃、K₃PO₄）悬浊液的自动化加样方法，使非均相反应首次进入纳摩尔筛选体系。

4. 构建光氧化还原催化反应平台，将光氧化还原催化（Ir/Ni、Ru/Ni）纳入高通量筛选范畴。

在分析端，研究引入MALDI-TOF质谱替代传统LC-MS，将1536个反应的分析时间从数小时压缩至11分钟。通过使用氘代内标均一化消除不同反应条件的影响，MALDI-TOF信号与UPLC-MS结果的相关性达到R²=0.85，命中/未命中分类准确率高达95%。

在这一升级版平台中，mosquito的角色也发生了变化： 它不仅同样要完成1536孔板内微量反应体系的构建，还需要将175 nL的样品精确点样到MALDI靶板上，并二次点样150 nL的基质溶液——从单纯的“反应构建者”升级为“反应构建+MALDI-TOF样品制备”的双重角色，成为连接“高通量化学合成”与“超高速质谱分析”的关键桥梁。

3.从化学合成到生物筛选（2018年 Nature）
NanoSAR——D2B的真正前身

如果说前两篇《Science》分别解决了“如何实现微量合成”和“如何拓展反应类型”的问题，那么2018年默克团队在《Nature》上发表的这项研究，则首次将纳摩尔级高通量合成与生物功能筛选直接对接，实现了“合成即测试”的D2B核心理念。尽管“Direct-to-Biology”这一术语直至2021年才由GSK正式提出，但本文所建立的“纳摩尔合成→粗产物混匀（pooling）→ ASMS亲和筛选”一体化流程，已完整包含了D2B范式的全部核心要素。

传统药物发现中，化合物合成后需经纯化才能进行生物活性测试——这是整个“设计-合成-测试-分析”（DMTA）循环中最耗时耗力的环节。这篇文章所建立的NanoSAR平台（D2B前身）彻底绕过了这一环节：每反应仅消耗<0.05 mg底物，在1536孔板中并行构建反应；将成功反应的粗产物按分子量差异混合pooling后，通过色谱分离蛋白-配体复合物，变性释放配体后由LC-MS定量检测。

在这一流程中，mosquito的角色贯穿始终：以25–1200 nL/次的精度将底物、亲核试剂、催化剂等分配到1536孔板中构建纳摩尔级反应；反应完成后，进一步将成功反应的产物等量混合制备“化合物pooling池”——从化学合成到生物样品制备，mosquito是贯穿整个NanoSAR工作流程的执行中枢。

从2015年1536孔板纳摩尔合成平台的建立，到2018年反应条件和类型的全面拓展，再到NanoSAR实现合成与生物筛选的一体化融合——三篇高分论文共同勾勒出一条清晰的技术演进路径：先造工具，再拓边界，最后通应用。而mosquito则以纳升级精准移液贯穿始终，从微量的化学合成反应体系构建到MALDI-TOF样品制备再到化合物的梯度稀释和pooling混合，将高通量化学与超快速分析/筛选无缝衔接，成为D2B范式从概念走向现实的关键执行者。

在下一期内容中，我们将进一步介绍D2B技术在PROTACT和分子胶领域的应用场景，以及mosquito对于这些应用场景的独特价值。