方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫（FMDV）定型ELISA检测全流程，依托Fluidot自动移液工作站自动取弃吸头、精准定量移液、微量匀速分液、程序记忆、批量自动化作业等核心优势，完成96孔板整板标准化加样、试剂等量添加等关键操作。设备全程匀速稳定吸排液，可彻底规避传统手动操作存在的微量体积偏差、手法差异、力度与速度不均、孔间一致性差等问题，同时通过自动换头、自动弃头功能有效降低样本交叉污染风险。标准化固化移液程序可消除人为操作偏差，大幅降低长时间批量实验的人工疲劳，显著提升定型ELISA反应体系一致性、孵育加样均一性与批次检测重复性，为猪口蹄疫病毒O、A、Asia1等主要血清型快速定型、病原精准筛查、流行病学分型监测提供高效、标准化、可追溯的自动化实验方案。
 
 
方案详情：
一、实验原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）基于抗原与抗体的特异性结合反应。在猪口蹄疫定型 ELISA 中，将各型特异性捕获抗体固定于固相载体（96 孔板）上，加入待检样品、对照抗原及相应的检测抗体。若样品中含有对应血清型的 FMDV 抗原，则会与捕获抗体结合，随后通过酶标二抗与底物的显色反应，经酶标仪读取吸光度（OD 值）来判定样品的阳性、阴性或可疑状态，从而实现病毒血清型的精准定型。
 
二、‌实验准备
1、器材
① Fluidot自动移液工作站；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
2、试剂
① 捕获抗体:各型免抗FMDV 146S抗原抗血清，由提纯的各型FMDV 146S完整病毒粒子免疫兔子制备而成，用pH9.6的包被缓冲液将捕获抗体稀释至工作浓度；
② 检测抗体:各型豚鼠抗FMDV146S抗原抗血清，用与制备捕获抗体同源的各型FMDV146S完整病毒粒子免疫豚鼠制备而成;或者是辣根过氧化物酶(HRP)标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体，用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度；
③ 对照抗原:FMDV灭活抗原。FMDV于单层BHK-21细胞上繁殖,病毒培养液经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片，上清液作为对照抗原，使用时用样品稀释液稀释至工作浓度；
④ 被缓冲液；
⑤ 样品稀释液；
⑥ 酶标抗体稀释液；
⑦ 洗涤缓冲液；
⑧ 底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 兔抗豚鼠IgGHRP标记物。
 
三、实验步骤
1、启动Fluidot自动移液工作站，提前预设好分液程序后，仪器自动拾取无菌吸头，将稀释至工作浓度的O型、A型、Asia1型FMDV捕获抗体依次加至96孔酶标板对应列，单孔加样量50μL，可根据样品数量灵活调整包被孔位。加样完成后设备自动弃除废吸头，整板覆膜密封。可选择4℃过夜包被，或38℃±0.5℃、100～200r/min振荡孵育2h。
 
 
2、仪器自动吸取吸头，每孔中加满洗涤缓冲液，放置30 s后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。
3、仪器自动在ELISA板第1列A、B两孔加O型抗原,第2列A、B两孔加A型抗原，第3列A、B两孔加Asial型抗原，以此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每孔加50ul。每型设2孔阴性对照阴性对照孔每孔加50ul样品稀释液。用封板膜封板置于38℃±0.5℃旋转振荡器中振荡60min。重复步骤2，洗涤。
 
4、将工作浓度的豚鼠抗FMDV各型抗血清逐个加入与包被兔抗FMDV血清同型的各孔，即包被兔抗型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗A型FMDV抗血清，以此类推，每孔加50ul，封板后同前振荡孵育60min。洗涤后加兔抗豚鼠IgG HRP标记物,每孔加 50ul，封板后同前振荡孵育45 min,洗涤。或者将工作浓度HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加入到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，每孔加50ul，封板后同前振荡孵育60min，洗涤。
5、加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP标记物时,洗涤板子后使用Fluidot移液工作站，将预热至38 ℃±0.5℃的OPD底物溶液，每孔50ul加入到孔板中,封板，避光38 ℃±0.5 ℃振荡孵育15 min。取用新吸头，再每孔加50ul 1.25 mol/L的终止液，混匀后在酶标仪492nm下判读结果。加HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体时，洗涤板子后，使用Fluidot移液工作站将预热至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，每孔50ul，等量加入孔板中，封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15 min。再每孔加50ul 2 mol/L硫酸终止液，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。
 
四、试验成立条件
1、结果计算:相对OD值=被检样品各血清型平均OD值一同型阴性对照(N)平均OD值。
2、某型阴性对照(N)平均OD值＞0.20，试验不成立。
3、阳性对照OD值应≥0.6,阴性对照应≤0.20,试验成立。
五、结果判定
1、在试验成立的前提下:如果样品各型的相对OD值≤0.20,则该样品为阴性;
2、如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品此血清型阳性;
3、如果样品某型的相对 OD值＞0.2但＜0.3,则判为可疑，需要重新测定，再次测定结果，若某型的相对OD值＜0.30,则该样品为阴性，如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。