蛋白指纹图谱在生命科学中的应用
Protein Chip Fingerprinting in Life Sciences

一、Why proteins?
人类基因组草图所估计的3.5万基因中一半以上纯属理论推测，需要从蛋白质水平与以检验与确认，判断一个未知基因的功能，最终必须通过在蛋白水平的研究才能确定。
Genomics   DNA:      What could happen   
基因组学      ↓           可能发生
        mRNA:     What might happen 
              ↓           可以发生
Proteomics   Proteins:  What is actually happening
蛋白质组学                 实际正在发生   
Same genome                   Different proteome

二、蛋白质组和蛋白质组学的概念
蛋白质组是由澳大利亚科学家Wilkins和Williams在1994年率先提出，其定义为：一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学 分为表达蛋白质组学,细胞图谱蛋白质组学和功能蛋白质组学。
蛋白质组“全景式”分析，是认识重大疾病的基础。

三、SELDI技术的进展
1993年提出表面加强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术
1997年美国Ciphergen生物系统公司获SELDI专利技术独家使用权
1999年第一台蛋白质芯片－飞行时间质谱仪问世
2000年在NASDAQ上市，成为全球性公司。
2002年美国FDA和NCI合作，在柳叶刀杂志发表了关于卵巢癌的早期诊断报告，敏感性100%，特异性95%，奠定了SELDI技术用于临床诊断的基础
2002年 SELDI新产品型号PBSIIc型进入中国
2004年在美国Quest开始应用于卵巢癌的筛查
2004年中国国家食品药品监督管理局SFDA批准进口.批件号：国食药监械(进)字2003第2400768号
2005年SELDI被美国BioRad公司收购
2005年SELDI新产品型号PCS4000上市
2006年浙江省物价局批准用于临床肿瘤筛查 医技诊疗类H25030190100 蛋白指纹图谱500元/次
2006年在中国开始应用于12种肿瘤筛查
2008年北京伯奥克生物技术有限公司全面负责中国区域SELDI用户服务
2009年SELDI全球维修服务与技术支持网络开通http://www.seldiservice.com
2010年SELDI与布鲁克公司合作产品ultrafleXtremeTM MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱系统上市
2011年蛋白质芯片替代型耗材纳米磁珠
2012年自主创新型SELDI液体芯片飞行时间质谱系统（蛋白指纹图谱仪）上市 浙食药监械（准）字2012第2400147号

四、Ciphergen® SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization, time-of fight mass spectrometry)表面加强激光解吸电离飞行时间质谱仪(蛋白质指纹图谱仪)
ProteinChip SELDI系统用于从大量复杂生物学样品中快速获得蛋白质分子量图谱，发现Biomarker。它使用表面增强的激光解吸离子（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）技术来捕获、检测和测量复杂生物样品中的肽段和蛋白质的分子量。
布鲁克-道尔顿公司ultraflex III 基质辅助激光解吸附电离（MALDI）串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF）蛋白质芯片直接用于序列分析,大大缩短了蛋白质从纯化到序列鉴定的时间 

五、SELDI－TOF－MS原理示意图
SELDI-TOF-MS是一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（SELDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。SELDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。SELDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，是生命科学等领域一种强有力的分析测试手段，扮演着“基石”的作用。
 
六、SELDI技术的核心
利用系列不同化学表面修饰的芯片，使之能够选择性地结合一组蛋白质，以飞行时间质谱为检测器，测定结合到芯片上的所有蛋白质，并通过测定飞行时间得到分子量，再通过群体分析找到在两种条件下的差异蛋白质群。 实现在小量粗样品中，对整个细胞，组织或血清的蛋白质特性进行高通量快速分析。
 
七、在临床蛋白质组学研究中的能力和优势
直接用粗生物样品（血清、尿、体液、组织匀浆）进行分析
样品量低、范围宽(0.5 µl - 500 µl or  2000 cells)
同时快速发现多个生物标记物
低检测限(1 fmole of protein)
高通量的检测能力（ with >600s of samples a day）
发现低丰度、低分子量蛋白质
在同一系统中集分离、检测和数据分析为一体
 
八、蛋白质芯片操作流程图
SELDI蛋白质芯片的使用包括四个步骤：
步骤一：芯片类型的选择
蛋白质芯片提供了多种色谱的功能，包括亲水、疏水、阳离子交换、阴离子交换以及金属亲和表面等。此外，通过共价偶联选定的蛋白质或者其他目标分子，可以对芯片表面实现预活化，从而设计出具有更高针对性、特异性的芯片。
步骤二：上样
血清、细胞或者组织的裂解液、尿、脑脊液，或者其他蛋白质匀浆液等复杂的生物学样品——包括那些含有高浓度盐离子和去垢剂的样品——都可以直接上样于蛋白质芯片表面。样品通过手工加样或者自动上样仪进行点样。复杂蛋白质样品中的一个特定亚群将通过简单的化学作用或者蛋白质相互作用被芯片捕获。
步骤三：未结合成分的洗脱
孵育后，未结合的蛋白和其他成分从芯片表面洗脱掉。只有那些特异性结合的蛋白质才保留下来用于进一步的分析。这种选择性的洗脱进一步选取基于芯片特色的蛋白质集合。
步骤四：在SELDI蛋白质阅读机上进行分析
在洗脱步骤之后，点加上含有能量吸收分子（EAM）的有机溶液。EAMs对样品的离子化起关键作用。在蛋白质溶解到含有EAM的溶液之后，溶液挥发掉，在芯片表面形成蛋白质和EAMs的共结晶。
芯片在SELDI阅读机上进行分析，后者是一种时间飞行质谱。芯片阅读机内有一个氮源的激光器，导致离子化和解吸附过程的产生。激光能量诱导蛋白质离子化以及从晶体态到气态的转变。
一旦进入到气态，带电蛋白质分子在一个分离电压作用下迅速地运动，或称“飞行”。分离电压对样品中所有的分子具有相同的作用，使之表现出基于分子量差别的不同飞行时间。SELDI阅读机记录下这些飞行时间，换算成分子量。

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