GyrolabxPlore全自动纳升级免疫分析工作站的原理和应用
2015-07-29 来源:本站 点击次数:4395（一）应用范围
瑞典Gyros AB公司的GyrolabxPlore全自动纳升级免疫分析工作站是他们在高通量的GyrolabxP workstation的基础上开发的适用于中低通量实验室的新产品。GyrolabxPlore利用特制的微流控CD作为免疫反应的耗材，能在1小时内自动完成112个样本的免疫反应，得到高质量的数据。该产品已荣获“2015弗若斯特沙利文北美免疫实验市场新产品创新奖（2015 Frost & Sullivan’s North American Immunoassay Market New Product Innovation Award）”。
它适用于早期研发/临床前期/临床中期/上市后监管的大分子药物的药代动力学（PK：Pharmacokinetics）、药效动力学（PD：Pharmacodynamics）、毒动学（TK：Toxicokinetics）、免疫原性（Immunogenicity）、生物标记物监测（Biomarker Monitoring）、抗药抗体研究（ADA：Anti-drug Antibody）、IgG titer、Protein A检测、宿主细胞蛋白检测（HCP：Host Cell Protein）等多个领域。可以取代传统的ELISA反应，并具有优于ELISA的多种优势，如比ELISA上样量更少（纳升级），检测范围更宽，灵敏度更高，精密度更好。GyrolabxPlore的内部结构见图1。
图1. GyrolabxPlore的内部结构
图1标识说明：
1：机械臂，用来定位取样针和检测器；
2：洗针槽，确保没有交叉污染；
3：旋转盘，可放置1片CD，可精确控制CD中的液体流动和进行高灵敏度的检测；
4：安装在机械臂上的高灵敏度的激光诱导荧光检测器；
5：10根取样针，可以精确地将样本和试剂从微孔板中转移到CD中；
6：微孔板槽，可放置3块微孔板，用来装载样本、试剂和标准品。
（二）工作原理
GyrolabxPlore使用特制的微流控CD耗材，所有的试剂和样本的上样、吸附、洗脱和检测都在该CD中进行。一般的PK、PD反应在GyrolabBioaffy CD中进行。以Bioaffy 200 CD为例，GyrolabxPlore里面配备机械臂，运行时用移液针将样本和试剂精确地从微孔板转移到CD内的每一个微结构中，CD微结构中装有15nl链霉亲和素包裹的微珠亲和柱，CD以恰当的速度和时间精确旋转以保证样本和试剂平行流过亲和柱进行反应。微珠先与生物素捕捉试剂相结合，捕捉试剂再与待测样本特异性结合，最后接上带荧光团的二抗检测试剂，形成“链霉亲和素微珠-生物素捕获试剂-样本-二抗荧光检测试剂”的复合物。用激光激发荧光读数。整个流程由Gyrolab xPlore全自动完成，全自动检测1个CD 112个数据点仅需1小时。
图2. 左图：GyrolabBioaffy 200 CD的微结构；右图：Gyrolab Mixing CD的微结构
图2标识说明：
1：通用试剂管路；
2：疏水障碍，可阻挡液流，确保液体定量的一致性；
3：亲和柱（15nL链霉亲和素包被的微珠）；
4：试剂体积定量区域（200nL）；
5：样本加入口；
6：体积定量腔，可精确定量样本体积（Bioaffy CD为20,200或1000nL，Bioaffy 200为200nL，Mixing CD为200nL）；
7：多余液体的溢流管路，可确保液体装满定量腔。
8：混合反应腔；
图3. “链霉亲和素微珠-生物素捕获试剂-样本-二抗荧光检测试剂”的复合物
用于常规实验的Gyrolab Bioaffy CD型号：
（1）Bioaffy 20HC：上样体积：20nL，数据点：112个；
（2）Bioaffy 200：上样体积：200nL，数据点：112个；
（3）Bioaffy 1000：上样体积：1000nL，数据点：96个。
用于抗药抗体（ADA）检测和Protein A检测的CD是GyrolabMixing CD。以ADA检测为例，Gyrolab的ADA处理方法分为两类：通过Bioaffy 200 CD进行的无需酸性解离的长时间平衡法，和通过Gyrolab Mixing CD进行的需要酸性解离的酸化中和法。酸化中和法中，药物和ADA的复合物与酸性缓冲液反应，发生解离，ADA游离出来。用含有生物素标记药物和荧光素标记药物的中和缓冲液中和。形成的“生物素药物-ADA-荧光标记药物”的复合物通过“链霉亲和素-生物素”作用结合在亲和柱上，用激光激发荧光，完成样本的荧光数值的检测。在一个小时内能完成48个样本的检测。
以Protein A检测为例，带生物素的捕获试剂先与亲和柱结合。IgG和Protein A的复合物与酸性缓冲液反应，发生解离，Protein A游离出来，结合到捕获试剂上。最后加入二抗荧光标记检测试剂，形成“链霉亲和素微珠-生物素捕获试剂-Protein A-二抗荧光检测试剂”的复合物。用激光激发荧光，完成样本的荧光数值的检测。在80min内能完成48个样本的检测。
该工作站使用Gyrolab Evaluator软件评估结果或者将结果导出至诸如LIMS系统之类的其他软件。软件符合美国联邦法规21 CFR part 11的要求，并能提供广泛的验证支持。
（三）与传统ELISA的对比及优势
传统ELISA具有很多不足，如：所需样本量大、反应时间长、动态范围窄、重复性不佳、无法自动化、耗费劳动力等。GyrolabxPlore可做ELISA的工作，但具有优于ELISA的多种优势，如：比ELISA上样量更少（纳升级），检测范围更宽，灵敏度更高，精密度更好。产品优势具体如下：
（1）节省时间：一小时得到结果，在几天内而非几周内开发新实验；
（2）节省样本量：纳升级的上样量（最少上样量20nl），减少实验动物的消耗，可实现一只小鼠连续取样，获得一组大分子药物代谢数据；
（3）节省劳动力：全自动运行，可自动完成112/96个样品的上样、吸附、洗脱、检测和数据分析；
（4）宽广的动态范围：将稀释度和重复性最小化，通过15nl亲和柱样品捕获反应体系，有效的提升数据动态范围，减少基质效应。
（5）灵活性：与高通量的GyrolabxP workstation使用同样的CD耗材和相似的软件，实验方法易于在不同的仪器和地点间转移，并能保证数据的高质量性。
Gyrolab xPlore工作站与传统ELISA方法的对比见表1：
|
参数 |
Gyrolab xPlore |
ELISA |
Gyros的改进 |
|
微孔板液体量 |
8µL |
100µL |
体积减少10倍 |
|
实验运行时间（包括coating时间） |
＜1小时 |
10小时 |
运行时间缩短10倍 |
|
动态范围 |
10.5-6400ng/ml |
88-666ng/ml |
动态范围扩大8倍 |
|
最小稀释倍数MRD |
1:2 |
1:20 |
MRD减小10倍 |
|
实验开发时间 |
3天 |
1个星期 |
开发速度提高2.3倍 |
|
能否自动化 |
能 |
否 |
有内置的自动化设备 |
|
是否受桌面实验影响 |
否 |
是 |
不受桌面实验影响 |
表1. Gyrolab xPlore工作站与传统ELISA方法的对比：数据来自Pfizer
（四）具体应用举例：
（1）药代动力学分析
候选生物药的药物代谢和动力学研究（DMPK）对微量体积的生物分析而言是一个挑战。GyrolabxPlore运行纳升级的免疫反应，从一只小鼠就能生成完整的PK曲线，见图4。Gyros技术基于用亲和柱捕获样本的形式，可以将基质的干扰最小化，并显著减少最小稀释倍数MRD，见图5，可见未稀释血清和1:4稀释血清的标准曲线几乎重合，实验时无需稀释样本。
图4. 三条来源于三只小鼠的完整的PK曲线（静脉注射治疗性抗体）：数据来自AstraZeneca
图5. 来源于未稀释血清（绿色）和1:4稀释血清（蓝色）的药物分子的标准曲线
（2）ADA检测
免疫原性（Immunogenicity）检测是生物药安全检测的必须的常规步骤之一。生物药的抗药抗体（ADA：Anti-drug Antibody）免疫实验是非常复杂的，受制于药物的容忍度（drug tolerance）和敏感性，并且需耗费大量的人力，较长的实验周期以将药物容忍度最大化，药物干扰最小化，需要过夜进行孵育和酸性样本预处理。Gyrolab的ADA处理方法分为两类：通过Bioaffy 200 CD进行的无需酸性解离的长时间平衡法，和通过Gyrolab Mixing CD进行的需要酸性解离的酸化中和法（具体见（二）工作原理）。两种方法的药物容忍度见图6。左图是用Bioaffy 200 CD进行的ADA检测实验，右图是用Gyrolab Mixing CD进行的ADA检测实验。左图方法无需酸性解离，对游离药物浓度的容忍度很低，说明可能需要增加酸性解离步骤。当有10µg/ml未标记药物存在时，能检测出250ng/ml的ADA。右图方法包括酸性解离，增加了对游离药物的容忍度，能在高达100µg/ml未标记药物存在时检测出250 ng/ml的ADA。Gyrolab方法的优势是：自动进行样本预处理，减少手工操作时间；大幅缩短实验时间，一小时内完成；节约珍贵的试剂和样本，仅需5µL样本就可做双重复；有专门的ADA软件和ADA缓冲液可供选择。
图6. 左图是用Bioaffy 200 CD进行的ADA检测实验，右图是用Gyrolab Mixing CD进行的ADA检测实验。
（3）HCP杂质检测
宿主细胞蛋白（HCP）杂质因为具有免疫原性，所以是生物药开发生产过程中的必检项目。对药物和HCP杂质进行快速、准确的定量是有效开发和优化生物工艺的关键。目前的技术，如ELISA和HPLC，能得到较好质量的结果，但在通量和动态范围方面存在不足。Gyrolab与ELISA相比具有显著的优势，如：更宽广的动态范围；更快的实验速度；精密度和重复性更好和可以实现自动化。
（a）动态范围：图7对比了用Gyrolab和ELISA对HCP杂质进行检测的结果。与ELISA方法相比，Gyrolab具有大100倍的动态范围。
图7. ELISA和Gyrolab的动态范围的对比：数据来自Merck
（b）准确性：图8显示各种纯化步骤中两种方法都显示了相同的实验结果。
图8. 各种纯化步骤中ELISA和Gyrolab检测到的HCP浓度的对比
（c）精密度：图9显示了两种方法对来源于各种纯化步骤的样本进行分析的对比，误差条（error bar）显示从Gyrolab得到的数据变化更小，精密度更高。
图9. 对一种治疗性蛋白的纯化过程的样本进行分析：数据来自MedImmune
（d）选择性：表2显示两种样本在不同稀释倍数下进行处理（HCP预计约为10,000 ng/ml），检测到的HCP浓度的CV值都小于10%（双重复），显示了极佳的稀释线性，最小稀释倍数为2倍。
|
|
MAb-A1 |
MAb-A2 | ||||
|
Dilution Factor(DF) |
Cv(%) |
Calc.Conc.(ng/ml) |
CV DF (%) |
Cv(%) |
Calc.Conc.(ng/ml) |
CV DF (%) |
|
100 |
10 |
10.50 |
9 |
4 |
13.50 |
10 |
|
50 |
9 |
11.05 |
6 |
13.30 | ||
|
10 |
5 |
9.82 |
1 |
12.24 | ||
|
2 |
2 |
9.12 |
5 |
10.80 | ||
表2. 样本在不同稀释倍数下的HCP浓度的CV值
（e）与ELISA方法的对比及优势：见表3，数据来自MedImmune和Merck。
|
HCP实验 |
手工ELISA |
Tecan ELISA |
Gyrolab |
|
每轮实验时间 |
4.5h（192个数据点） |
4.5h（192个数据点） |
1h（96个数据点） |
|
通量/天 |
192个数据 |
384个数据 |
960个数据 |
|
手工操作时间 |
3h（中间需要休息） |
每次30min |
每次10min |
|
动态范围（ng/ml） |
7-100 |
7-100 |
4-10,000 |
|
最小样本量（µL） |
50 |
50 |
8 |
|
实验成本 |
2倍 |
3倍 |
1倍 |
|
实验开发和评估时间 |
超过1周 |
超过1周 |
小于3天 |
表3. Gyrolab与ELISA进行HCP检测的对比
（4）Protein A杂质检测
Protein A可以和人IgG结合，是亲和层析纯化生物治疗产品的关键。然而Protein A会从层析树脂上脱落，和治疗性抗体产品一起被洗脱下来，成为生物工艺过程的杂质。所以在纯化工艺过程中准确定量检测Protein A是十分重要的。将未经处理的样本进行Protein A检测会低估污染的程度，因为IgG会占据Protein A的表位，所以样本必须经过Protein A和IgG的解离处理。在自动的用Gyrolab定量残余的Protein A配基的方法中，样本和酸性缓冲液在Gyrolab Mixing CD中进行反应，以解离Protein A和IgG的复合物。然后用夹心免疫方法对Protein A进行检测。具体见（二）工作原理。Protein A杂质的检测需要用到Gyros的Protein A试剂盒。
（a）特异性：三种来源于USP的Protein A都用Gyrolab Protein A试剂盒进行了准确定量。这三种分别是：天然Protein A；重组Protein A（E.coli）和重组Protein A，C-Cys（MabSelectSuRe），见图10。
图10.一系列Protein A分子的特异性
（b）准确性：对四种商业抗体进行Protein A和MabSelectSuReligand的内标，内标的回收率在能接受的范围内（±20%，n=2），见表4。
|
|
Therapeutic antibody 0.5mg/ml |
Recovery% | ||||
|
|
Ligan(ng/ml) |
hlgG1 |
HlgG2 |
Fcy/CTLA4 |
hlgG4 | |
|
ProteinA |
0.16 |
103 |
114 |
101 |
104 | |
|
1.48 |
95 |
102 |
89 |
97 | ||
|
13.3 |
81 |
99 |
85 |
90 | ||
|
MabSelect sure |
0.16 |
1.5 |
117 |
103 |
104 | |
|
1.48 |
88 |
111 |
90 |
85 | ||
|
13.3 |
84 |
113 |
84 |
87 | ||
表4. Protein A内标的回收率
（c）精密度和重复性：数据为天然Protein A标准曲线，显示CV很小。标准曲线范围是：0.055-40ng/ml。见表5。图11为三个连续的标准曲线，显示了极佳的线性和重复性。
|
Sample |
Conc.(ng/mL) |
Mean Response(n=2) |
S/B |
%CV |
|
Blank |
0 |
0.32 |
|
|
|
1 |
0.055 |
0.86 |
2.69 |
7.6 |
|
2 |
0.16 |
1.90 |
5.94 |
0.6 |
|
3 |
0.49 |
5.23 |
16.3 |
5.5 |
|
4 |
1.48 |
14.9 |
46.5 |
6.9 |
|
5 |
4.44 |
43.7 |
136 |
2.3 |
|
6 |
13.3 |
117 |
366 |
6.9 |
|
7 |
40 |
3000 |
940 |
0.9 |
表5. 天然Protein A标准曲线
图11. 三个连续的标准曲线
（d）灵敏性：灵敏性检测使用稀释至0.5mg/ml的商用治疗性单克隆抗体，加入内标Protein A。见表6。
|
Sensitivity performance characteristics | |
|
Protein A range |
0.055-40 ng/ml |
|
CV |
<10%(for LLOQ) |
|
Bias |
-20%(for LLOQ) |
|
LLOQ |
0.1ng/ml |
|
LOD |
0.055ng/ml |
表6. 灵敏性检测
（e）与ELISA方法的对比及优势：见表7，数据来源于Cobra Biologics，Sweden。
|
|
Gyrolab工作站和Gyrolab Protein A Kit |
商业ELISA Kit |
|
样本准备 |
30 min |
45min |
|
样本处理——酸化 |
自动进行 |
手工进行 |
|
样本消耗 |
10µL |
500µL |
|
IgG容忍性 |
0.5 mg/ml |
0.125 mg/ml |
|
动态范围 |
0.055-40 ng/ml |
0.05-1.6 ng/ml |
|
实验运行时间 |
80 min/CD |
90 min/板 |
|
运行一次的数据量 |
48 /CD |
96 孔/板 |
|
通量 |
10 CD/天（自动） |
5 块板/天（手工） |
|
灵敏度（LLOQ） |
0.1 ng/ml，0.2 ppm |
0.1ng/ml，0.8 ppm |
|
是否受其他实验干扰 |
否 |
是 |
表7. Gyrolab与ELISA进行Protein A检测的对比
（f）小结：Gyrolab可以定量残余的天然Protein A，重组Protein A变体和MabSelectSuRe。能在80min内得到高质量的数据，具有极高的灵敏度，精确度，准确性和重复性。Gyrolab的解决方案整体上优于ELISA。Protein A试剂盒易于使用，自动化的样本酸化过程减少了手工操作的步骤和时间，降低了误差风险，能生成一致性的数据结果。
（五）总结
GyrolabxPlore可在CD形式的纳升级微流控结构中进行自动化的免疫反应。CD上的每个微结构包含一个15nl的预装有链霉亲和素包被微珠的亲和柱，支持多种免疫实验，包括抗体夹心法和非直接的抗体方法。与使用微孔板的ELISA方法对比，它对样本和试剂的消耗都显著减少。微流控技术保证CD上的所有样本都能平行处理，产生一致性的结果。每个微结构等同于一个数据点，消除了交叉污染。该产品的控制和分析软件符合21 CFR part 11规定，确保实验能在GMP和GLP环境下进行开发和转移。对于生物工艺和生产流程，微小化的反应量、更快的反应时间，更宽广的动态范围和极佳的准确性、精密性和重复性使Gyrolab产品成为您理想的免疫反应工具，支持生物工艺和生产的各个流程。
Gyrolab系列产品已进入多家生物制药公司、CRO、CMO和研发机构，部分现有客户见图12。
图12. Gyrolab产品的现有客户
大中华区总代理：上海典奥生物科技有限公司。更多信息，请参考Gyros网站：www.gyros.com和上海典奥生物科技有限公司网站：www.tekontech.com，或关注微信公众号”典奥生物科技”：tekontech。
产品介绍链接：
（1）中低通量的GyrolabxPlore（1块CD）：http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=3541191
（2）高通量的GyrolabxP workstation（5块CD）：http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=3146093
产品咨询请联系市场部刘经理，电话：（+86）21-58605185，传真：（+86）21-51973282，邮箱：marketing@tekon.net
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