陆军军医大学陆军特色医学中心
随着社会老龄化程度不断升高,导致椎间盘退行性疾病的发病率日渐上升,并呈年轻化趋势。椎间盘退行性疾病(DDD)是导致腰腿部位疼痛的主要原因,不仅影响患者的生活质量,而且对社会的医疗和经济资源带来了沉重的负担。
目前对于DDD的治疗,主要依靠卧床、康复治疗、药物、介入及手术治疗等手段,但这些手段只能减轻患者的症状,很难重建椎间盘(IVD)的稳态环境。因此,急需深入探索椎间盘生理与病理机制,对椎间盘退行性疾病的治疗具有重大指导意义。近日,陆军军医大学陆军特色医学中心(重庆大坪医院)骨科 刘鹏课题组 与中国人民解放军总医院第五医学中心 刘兵课题组 联合,在陆军医大学陆军特色医学中心(重庆大坪医院) 陈林课题组 的支持下,绘制了首个人类椎间盘细胞图谱,在Bone Research发表了题为 Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs的封面研究论文。
此外,为了验证这种椎间盘细胞的异质性在物种间具有高度的保守性,作者比较了人类与大鼠间椎间盘细胞的单细胞转录组测序数据,发现多数在人类椎间盘的细胞亚群在大鼠椎间盘中同样存在,包括髓核祖细胞,内皮细胞,以及周细胞。
图1:健康人椎间盘中AF(纤维环)NP(髓核)CEP(软骨终板)的免疫组化染色
作者通过进一步的研究,根据功能的差异,将椎间盘软骨细胞分为三类:
1、调控型软骨细胞通过活跃的生长因子表达和成软骨信号通路调控,在软骨ECM稳态中发挥重要作用。
2、高度分化的稳态软骨细胞处于静息状态,主要负责ECM的沉积。
图2:免疫荧光染色显示PDGFRA/PROCR/PRRX1在人类椎间盘细胞内的共表达情况
随后,作者通过流式细胞分选,将不同的细胞亚群进行了纯化富集。
通过体外实验,研究人员发现与PROCR-细胞亚群相比,PROCR+亚群具有很强的体外克隆形成能力。免疫荧光染色结果提示,在PROCR+细胞亚群中,软骨生成相关转录因子p-SMAD3高度活化(图3)。最后的体外分化实验证实,PROCR+祖细胞具有成骨、成软骨以及成脂的三系分化能力(图4)。
图3:免疫荧光染色揭示PROCR+ 与PROCR- 亚群中p-SMAD3的表达差异
综上,该研究通过单细胞表达谱测序,首次绘制了人类的椎间盘单细胞图谱,在单细胞水平上定义了软骨细胞亚群,让我们对椎间盘细胞的异质性有了全新认识;并且作者在空间上对这些不同的亚群进行了解析和定位,通过基因分析揭示了它们的调控特征。
此外,作者团队在髓核中鉴定得到一群具有干性潜能的祖细胞,为人类椎间盘退行性疾病的治疗提供了新的理论基础。
文中组织切片的图像主要利用奥林巴斯VS200研究级全玻片扫描系统获得,该系统支持明场与荧光等五种常见的观察方法,通过配置的X Line高性能物镜,可以为用户提供平场性更好的图像;自动聚焦和自动样品检测功能可以使系统的拍摄效率大大提高,同时不失精准;TruAI深度学习技术的强大功能,可以准确识别出样品的形态特征,并且可以准确分割目标区域,在简单易学的前提下帮助用户节约分析图像的时间。
此外,细胞的免疫荧光染色图像主要通过奥林巴斯全新一代超高分辨转盘共聚焦系统SpinSR10获得,该系统具有奥林巴斯特有的超高分辨模块,无需特殊荧光标记染料,XY分辨率可达到110nm,轻松解析精细结构;基于转盘的共聚焦扫描单元可以实现高帧率的图像采集,不错过每一个瞬间;该系统极低的光毒性对标本的破坏很小,尤其适用于活细胞的观察。
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