如何在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平台进行低多样性文库测序
若希望低多样性文库在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平台上获得精确和稳定的测序结果，需要精心设计的实验以及良好的生信分析。低多样性文库最常见的例子是基于扩增方法制备的文库，例如16S宏基因组文库。这些文库扩增引物结合的位置，即起始位点的DNA序列基本是相同的。单一的位点会导致碱基组成不平衡，以至于碱基组成从一个循环到下一个循环可能会发生剧烈变化。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™系统使用的是双通道测序技术。因此，确保每个循环中均存在4种DNA碱基是非常重要的，这样分析软件才能正确鉴定DNA簇并精确读取碱基序列。低多样性文库测序时，为了满足这种要求，我们建议在设计实验时，采用以下几种方法保证每个循环的多样性。

利用标签区分技术，在测序中加入多个带有标签的来自多种应用的样品, 关于NextSeq™ 500/550和MiniSeq™测序系统上Index混合的指导方针我们会在下面详细介绍。

· 用多样性较高应用的带有标签的样品，例如全基因组测序文库，来增加文库碱基多样性

· 为了获得最佳测序结果，可以利用单标签或者双标签技术，将多个样品在同一张Flow Cell上进行测序

在测序时掺入全基因组样品（例如PhiX）

· 可以加入50% PhiX为初始掺入比例，然后根据一级分析和二级分析的结果，逐步降低PhiX掺入比例。掺入这样的样品能提供每个循环必需的碱基多样性。

在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平台原始簇密度最佳范围如下所示, 而低多样性文库在此基础上须视情况降低上样量以提升测序质量：

· MiniSeq™试剂原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2

· NextSeq™ 500/550试剂原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™测序系统Index混合的指导方针

在NextSeq™ 500/550 和MiniSeq™测序系统上对混合文库进行Index测序时，非常重要的一点是要选择合适的Index组合，否则可能会因为读Index时簇定位失败而导致Index测序失败。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™为双通道测序
NextSeq™ 500/550和MiniSeq™测序系统只需要2张图片就可以区分4种碱基：一张图片来自红光通道，另一张图片来自绿光通道。不同于每种碱基各带一种单独的荧光标记的四通道测序，双通道测序使用两种荧光染料，C碱基标记红色，T碱基标记绿色，A碱基同时标记红色和绿色，G碱基没有荧光标记。
 

 

图1：双通道SBS荧光成像（假彩色图片仅是效果图）为了提高4种DNA碱基的检测速度，MiniSeq™和NextSeq™ 500/550只用了2个图像分别捕捉红色和绿色波段的信号。仅在红色或绿色图像检测到的cluster分别被转译为C和T碱基。同时在红色图像和绿色图像被检测到的cluster被转译为A碱基，在两张图片中都没有检测到信号的cluster将被认为是G碱基。

NextSeq™500/550和MiniSeq™相关Index的考量

Index reads中前两个循环必须至少有一个碱基不是G。如果Index read前面两个碱基都是G，就会由于没有荧光信号导致cluster定位失败，所以Index的前两个循环中必须有一个碱基有信号才能确保Index的正常拆分。

选择Index进行组合时，每个循环都至少有一个通道有信号，最好是两个通道都有信号。这样碱基读取的过程才能确保数据分析的精确。

· 红色通道对应A或者C碱基

· 绿色通道对应A或者T碱基

Index组合的示例

理想的Index组合：每个循环需要两个通道都有信号

可接受的Index组合：只有一个通道有信号，但是仍然有足够的信号进行测序

不好的Index组合：Index read前两个碱基都是G，没有信号产生，导致cluster定位失败。

上述中的这些建议能够使得NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平台进行低多样性文库测序。