Scale-X™生物反应器的种子扩增强化
优化种子培养策略，更快，更低成本的扩大, 实现细胞收获

应用笔记
Thomas Robert¹, Jean-Christophe Drugmand¹, Antoine Hubert¹, Tania Pereira Chilima¹
1 Univercells Technologies

简介
长期以来，贴壁细胞培养平台的使用一直被视为生产疫苗和基因疗法的金标准。在上市速度是关键的领域，这些技术相对容易采用的优势可以带来显著的好处。然而，使用塑料培养容器等传统贴壁技术缺乏可放大性，使其成为晚期临床或商业规模生产成本高昂的选择⁽¹⁾。

固定床生物反应器可以为基于贴壁细胞培养的病毒生产提供可放大且强化的替代方案，从而应对上述挑战。scale-X™ 结构化卷膜固定床生物反应器有多种尺寸可供选择，包括 scale-X hydro、carbo和nitro型号（可用于细胞生长的表面积分别为 2.4 m²、10-30 m²和200-600 m²）支持产品开发、临床和商业化生产⁽²⁾。scale-X 生物反应器的设计范围旨在不同规模条件下保持相同的微环境，其已被证明可以显著提高各种细胞病毒产品的细胞密度和特异性生产率^(3-6)。Univercells Technologies 最大的生物反应器 scale-X nitro 200 和 600 型号在 NevoLine™ Upstream 平台内运行，该平台集成了上游和中游工艺步骤，从而提供了减少占地面积和端到端自动化的额外好处 ⁽⁷⁾。

虽然与病毒生产强化相关的好处是显著的，但它们并没有消除与大规模贴壁工艺相关的关键瓶颈：种子扩增。为 scale-X nitro 600 等生物反应器生产必要的细胞接种液需要多个扩增步骤，通常在塑料培养容器中进行（图 1），这会产生巨大的成本并增加操作次数，从而与操作员相关的错误的可能性更高。认识到这一关键挑战，Univercells Technologies 设计了一种解决方案，其能够通过酶和机械作用的组合从 scale-X 固定床收获细胞，其原理与当前基于塑料培养容器的方法相似。机械作用是通过一种符合 GMP 的新型细胞收获模块提供的，该模块设计与 scale-X carbo 系统集成（图 2）。这将有效地使 scale-X carbo生物反应器能够用作大规模贴壁细胞工艺的种子扩增培养强化解决方案。

本应用笔记将详细介绍利用 scale-X carbo生物反应器作为 scale-X nitro生物反应器种子培养强化解决方案的可行性。为此，使用 scale-X hydro (2.4 m²) 测试了细胞分离方案，并放大到 carbo 10 和 30 生物反应器。实验研究了从固定床分离贴壁细胞的能力，以及收获细胞的活性及其分离后的生长曲线和表型。实验结果与详细的成本模型相结合，以评估种子扩增培养强化的经济影响。
  上图描述了使用塑料培养容器（T 瓶和多层容器）制备 600 m² 固定床生物反应器接种液所需的连续步骤。假设：1）塑料培养容器的接种密度为 3x104，大规模 nitro 600 生物反应器的接种密度为 1x104，2）塑料培养容器的收获产量为 2x105 cells/cm²，3）每个多层容器 (MT) 表面积为632 cm²。
  scale-X carbo收获模块的概念示意图。左：scale-X carbo 控制器（用于 GMP 和非 GMP 细胞培养的商业化产品）。右图：概念细胞收获模块（*现在的前端开发）。
 
 
材料和方法

细胞培养材料和条件

来自冻存细胞库（18H003，ECACC）的贴壁HEK293 细胞用于所有实验。在添加有 5% 胎牛血清的DMEM（4.5 g/L 葡萄糖）中进行 T 瓶、多层培养容器和生物反应器培养。在生物反应器中进行细胞培养之前，将细胞在 T 瓶和多层容器中预培养达到所需的接种液。每3至4天进行一次传代。

生物反应器培养

在表 1 中详述的条件下，将细胞接种在 scale-X hydro、carbo 10 和 30 生物反应器中，在开始细胞生长期之前，这些反应器以批次模式保持 4 小时，以促进细胞粘附。培养基和固定床采样载体的每日样品分别通过葡萄糖和乳酸测量以及直接细胞计数用于评估细胞生长。
   
细胞收获模块

在本研究中，目前正在申请专利的开发中专用收获模块的原型被用于促进酶孵育后的细胞分离。收获模块由一个连接到平台生物反应器以产生机械作用（低振幅和高频振动）的装置组成（图 2）。

生物反应器的细胞收获液

在扩增 4 到 6 天后，从生物反应器中进行收获。在收获之前，清空生物反应器并用 37°C 预热的、含有 5 mM EDTA 的 DPBS 溶液 (DPBS-EDTA) 冲洗 2-5 次（取决于生物反应器型号）。随后，将 37°C 预热的分离溶液添加到生物反应器中，然后在搅拌（固定床内的线速度为 0.5 cm/s）和温度控制（37°C）条件下孵育 20-25 min。对于本研究，使用 Accumax™ 酶溶液（Innovative Cell Technologies），1X或在 DPBS-EDTA 中1:3 稀释。在酶孵育后，生物反应器移至收获模块进行振动处理，同时容器排液。在某些情况下，在第一次收获之后，用酶溶液进行多次冲洗。在所有情况下，收获后，生物反应器用 DPBS-EDTA 冲洗 1-5 次。在一些或所有冲洗步骤期间施加振动。在收获过程的各个步骤中采集固定床载体和上清液样品，以确定收获效率和细胞活性。细胞收获方案的概况如图 3 所示。

细胞数量检测

使用血细胞计数器通过台盼蓝染料排除法测量收获细胞中的细胞密度和活性。通过细胞裂解（scale-X 细胞计数试剂盒，Univercells Technologies）并进行结晶紫染色和用血细胞计数器计数细胞核，进行采样载体的生物量评估。固定床纤维上的细胞核计数用于估计生物反应器内的总细胞数。细胞收获后，拆解生物反应器，从代表性位置取出固定床的一部分，以评估固定床上剩余的细胞密度。

再接种实验

从所有生物反应器收获的细胞接种在 T 瓶中，以评估第一次传代时的再接种效率、细胞形态、活性和细胞回收。与从塑料培养容器中收获的对照细胞相比，评估了种群倍增时间 (PDT值) 和细胞形态。此外，从一个hydro (#5) 和一个carbo 10 (#2) 生物反应器中收获的细胞被用于接种新的hydro生物反应器，以为“固定床到固定床”接种提供概念验证。使用固定床收获细胞的接种条件如前所述。

成本建模

为了评估种子扩增强化的经济影响，使用 BioSolve Process 软件（Biopharm Services Limited，英国）进行了成本估算。该模型旨在比较两种情况：仅使用塑料培养瓶和多层细胞堆栈的传统种子扩增链（如图 1 所示），或通过一个 scale-X carbo 30 生物反应器步骤替换最后两个扩增步骤的等效工艺。该模型使用以下主要假设：

1. 600 m² 生物反应器的目标接种液为1x104 cells/cm²（总共 600 亿细胞）；
2. 所有培养瓶和多层容器的接种密度为 3x104cells/cm²，scale-X carbo 30 生物反应器的接种密度为 1x104 cells/cm²；
3. 所有培养瓶和多层容器步骤在B级洁净室进行细胞培养；
4. 所有生物反应器步骤在C级洁净室进行细胞培养；
5. 对于培养容器和 scale-X carbo生物反应器，收获细胞产量为 2x105 cells/cm²。
 
假设每年 25 个批次，按批次或每年计算产出。
  细胞在 scale-X 生物反应器中扩增 4-6 天 (1)。在收获当天，冲洗生物反应器 (2)，然后用酶溶液充满并孵育 20-25 min (3)。随后，将生物反应器转移到收获模块，同时施加振动和排液(4)。最后，进行冲洗，以进行细胞回收 (5)。步骤 1-3 使用安装在 scale-X hydro/carbo控制器上的生物反应器进行。对于步骤 4-5，这些生物反应器转移到收获模块。
 
 
结果

细胞收获效率

本文中描述的所有实验均使用未稀释或 1:3稀释的 Accumax 进行，因为初步研究已确定与 TryPLE 相比，其性能有所提高（数据未显示）。用 Accumax 孵育之后进行收获步骤以及随后的多个冲洗步骤。对不同收获方法的评估表明，一个收获循环后至少 2 个冲洗循环，同时结合收获模块的振动，在回收细胞方面最有效（数据未显示）。在所有实验中，对收获前后采样载体的分析表明，>90% 的细胞从固定床基质中分离出来（表 2）。总的来说，可以从 scale-X hydro生物反应器中以单细胞悬液的形式收获 2.7 到 5.1x109 细胞。此外，可以在对数期中期（2-3x105cells/cm²）以及接近融合期（4-5x105 cells/cm²）从生物反应器中收获细胞，这表明在收获时优化细胞数量对于实现最高的收获产量至关重要。塑料培养容器中的细胞收获通常以 2x105 cells/cm² 的细胞密度进行，这突显了固定床生物反应器能够以更高密度收获细胞的优势。

规模放大至carbo 10 和 30 生物反应器

在hydro规模的概念验证和优化之后，进行了额外的细胞收获实验，以研究收获性能的可放大性以及 scale-X carbo 10 (n=2) 和 30 (n=1) 规模。在所有3次收获中，> 98% 的细胞从固定床基质中分离出来。此外，从 scale-X carbo 30 中以单细胞悬液的形式收获了多达 5.2x1010细胞（表 2），因此提供了足够的细胞，可以 8.6x10³ cells/cm²接种 scale-X nitro 600。此外，在hydro规模下可以观察到高达 2.1x109 cells/m² 的细胞产量，如果将其转移至carbo 30，则可能以 1x104 cells/cm² 的密度接种 nitro 600。  
细胞活性和再接种

在本研究进行的所有实验中，收获的细胞都表现出高活性（84% 到 96% 之间）（表 2）。用从每个生物反应器收获的细胞进行再接种实验。这些实验是成功的，因为实现了 29-37 小时的 PDT（与 T 瓶传代对照细胞的29-39 小时相比）（图 4）。此外，从 scale-X hydro中收获的细胞（表 2 中的 Hydro #4）也用于接种第二个 Hydro（表 2 中的 Hydro #5），其中观察到了目标细胞生长（图 4）。然后从第二个hydro中收获细胞，为“固定床到固定床”接种提供概念验证。这一概念也在carbo规模（第二个carbo运行）中得到验证，其中carbo生物反应器使用从hydro生物反应器（未显示）收获的细胞进行接种。

由于这些固定床到固定床传代旨在研究用于接种 scale-X nitro 600 生物反应器的条件，因此评估了收获的细胞悬液中的残留酶浓度和细胞聚集。即使在没有额外的漂洗或浓缩步骤的情况下，这些参数也足够低，不会干扰细胞从另一个固定床收获后附着在固定床上的能力。 A)从所有生物反应器运行中收获的细胞被重新接种在 T 瓶中，用于生长曲线和形态评估。显示了从固定床生物反应器收获的细胞（左）以及从 T 瓶中收获的对照细胞（右）在重新接种后第 3 天的显微照片。B）从一个scale-X hydro生物反应器（#4）收获的细胞用于接种第二个hydro生物反应器（#5）。图中显示了两次连续运行中细胞密度（左轴）和代谢物乳酸和葡萄糖浓度（右轴）的变化趋势。箭头表示收获和重新接种到第二个生物反应器的时间。
 
用于大规模贴壁生产的种子扩增链的工艺经济性

研究进行了工艺经济性分析，以评估用于 scale-X nitro 600 生物反应器的种子培养强化的经济效益。该模型旨在对仅使用培养瓶和多层细胞堆栈的种子扩增链与通过一个 scale-X carbo 30 生物反应器步骤替换最后两个扩增步骤的等效工艺进行比较。

如图 5 所示，结果表明，当使用 scale-X carbo 30 生物反应器替换多层培养容器步骤时，主要成本驱动类别显著节省。与工厂、劳动力和材料成本相关的节省分别达到 21%、32% 和 40%。此外，与传统的多层容器相比，使用 scale-X carbo生物反应器还可以将种子扩增步骤的数量减少 1 个（5 步 vs. 塑料培养容器的 6 步），同时降低无菌风险并提高过程控制。

上述优势的一个关键因素在于，scale-X 生物反应器可以使用较低的接种密度（1x104 cells/cm² vs. 多层容器的3x104 cells/cm²）进行接种。此外，使用封闭的自动化系统可以在 C 级房间中进行操作，从而将 B 级区域所需的面积减少 41%（未显示）。总而言之，这些结果突显了与大规模贴壁生物反应器的种子扩增制备自动化相关的显著经济效益。
  对使用塑料培养容器和使用 scale-X carbo 30、以 1x104 cells/cm²接种 600 m² 固定床生物反应器的工艺进行了比较，计算了整体成本估算。结果仅包括种子扩增阶段的成本。本研究未涵盖连续单元操作的成本。使用的关键假设在材料和方法部分中有详细说明。
 
 
讨论和总结

本文详细介绍了评估使用 scale-X 生物反应器进行种子扩增强化的可行性和可放大性的一系列实验。该研究表明，在多个生物反应器规模（从 scale-X hydro 到 carbo 10 和 carbo 30）成功地实现了 >90% 的分离效率。收获方法遵循塑料培养容器的既定工艺，先进行酶处理，然后通过机械作用，促进细胞分离。这项研究的成功归功于技术设计本身，因为 scale-X 生物反应器提供了结构化固定床设计，有助于分离后的细胞收获，同时仍保持高压实度（每单位体积的表面积）以实现高细胞密度。此外，这种结构化的固定床设计在从hydro到carbo规模的放大研究中也发挥了重要作用，因为它能够跨规模维持相同的微环境。

收获的细胞也显示出了 > 90% 的活性，并且在再接种实验中，它们的生长动力学与对照条件相当，即使接种在另一个固定床生物反应器中时，这表明在固定床中时，细胞经历与在塑料容器中相似的微环境，而又受益于生物反应器可以提供的额外过程控制（pH、DO 和温度）。数据表明，从单个scale-X carbo 30 收获细胞可以产生所需的接种液，以 1x104 cells/cm²接种大规模固定床生物反应器，例如 scale-X nitro 600。

虽然收获方案在本研究测试的条件下是有效的，但可能需要针对特定工艺的优化，以达到各种配置中所需的接种要求（而各种细胞特性、类型不一，这数据只能供参考）。需要优化的参数可能包括振动的频率和/或持续时间、酶类型、浓度和孵育时间，或冲洗步骤的数量。我们预计，基于这种优化，目前的细胞收获解决方案可能与广泛的应用兼容。

成本建模研究突显了使用 scale-X 生物反应器实现种子扩增自动化所带来的显著节省。该模型强调了工厂、材料和劳动力成本的降低。此外，在最后的种子培养步骤中实施 scale-X carbo生物反应器可以通过使用封闭的自动化生物反应器降低无菌风险，从而降低这一关键工艺的风险。除了成本和风险之外，使用 scale-X carbo生物反应器强化种子培养还将减少液体和固体废物。

本研究是使用目前正在申请专利的开发中专用收获模块的原型进行的。这个新的附加模块设计用于在 scale-X carbo控制系统中完全集成，提供有助于符合 GMP 要求的自动化和可追溯性水平。与这种新型系统兼容的专用一次性耗材将实现具有成本效益的细胞扩增和收获。本应用笔记中显示的数据展示了这种新型收获模块如何应对用于病毒生产的种子培养中重大挑战。
 
 
参考文献：

1. R. Baghirzade, Adherent versus suspension based platforms: what is the near future of viral vector manufacturing? Cell Gene Ther. Insights. 7, 1365–1371 (2021).
2. T. Pereira Chilima, Innovative fixed-bed bioreactors unify adherent & suspension processing. Univercells Technol. (2021).
3. D. M. Berrie, R. C. Waters, C. Montoya, A. Chatel, E. M. Vela,Development of a high-yield live-virus vaccine production platform using a novel fixed-bed bioreactor. Vaccine. 38, 3639–3645 (2020).
4. A. Chatel, Y. Ghislain, P. Puri, T. Zijdemans, “Scalable Rubella production in scale-X™ bioreactor with MRC-5 cells: Process optimization and scale-up from static flask to scale-X bioreactor with 30 m2 cell growth surface” (2021).
5. R. Carvalho, T. P. Chilima, C. Meeüs, E. Gateau, M. Ferraiuolo, A. Noto, “Suspension-based viral vector production in scale-™ fixed-bed bioreactor Shake flask process transferred in a scale-X hydro fixed-bed bioreactor for Adenovirus production with HEK293 cells adapted to suspension.” (2021).
6. J.-C. Drugmand, A. Chatel, J. Castillo, Y. Dohogne, M. Gras, F. Collignon, S. Kumano, H. Shiomi, scale-X™ bioreactor for viral vector production: Proof of concept for scalable HEK293 cell growth and adenovirus production, (2020)
7. Univercells Technologies, The NevoLine™ Upstream platform -Intensified an automated virus manufacturing (2022), (available at https://www.univercellstech.com/products/nevolineupstream/).
 
 
scale-X™ carbo固定床生物反应器