蛋白质水平的多重免疫组织化学（mIHC）和多重免疫荧光（mIF）能分析、量化肿瘤中免疫细胞亚群、其功能状态及其在肿瘤微环境中的空间排列等，是目前检测肿瘤微环境免疫状态的核心技术。在准备开展mIHC/mIHC时样本数量、多通道成像、预算和是否有图像分析能力是重点考虑的事情。由于所有多重免疫组化（mIHC/mIF）都有创建和验证多种抗体组合的过程，我们南京泰立瑞的建议基本上都是关于创建一个由10-60个抗体组成的多重免疫组化检测模块的。我们提供了一个基于多重mIHC/mIF的初级介绍，整理了关键资料，并概述了计划和执行此类实验的主要考虑因素，主要受众是基础或转化医疗研发人员，或准备开展mIHC/mIF常规检测前建立方法学的临床病理、检验人员。

本篇是mIHC/mIF系列的第四篇，主要讨论多重免疫组化/多重荧光（mIHC/mIF）检测中抗体选择、抗体panel设计和开发。

抗体最终性能取决于组织类型、保存方法、抗原修复条件、最终抗体浓度、孵育缓冲液和检测方法，因此必须针对每个工作流程验证抗体（图一）。对于基于多重免疫组化mIHC /mIF，我们建议要考虑到：

1）抗体靶点的组织和亚细胞位置，

2）一定要有阳性和阴性组织对照，

3）组织自荧光和其他类型的背景，

4）标记物兼容性（例如，抗体之间没有交叉反应或空间位阻），

5）通过单IF或IHC实验确认抗体特异性，

6）信噪比，特别是对于无法进行信号放大的实验。

抗体特异性搜索引擎（表一），定期更新的蛋白质数据库如NCBI、Human Protein Atlas、UniProt等可以帮助确定标记的位置和相对丰度。纳入这些国外信息主要是因为其抗体覆盖面大，支撑文献、资料公开、详细，国内生产抗体主要供免疫组化的厂商应该也能满足开展多重免疫组化的需求。利用这些信息，我们可以使用适当的组织验证抗体，因为这些组织中有明确的目标蛋白质分子表达。通过使用基因敲除细胞系或具有不同靶点空间表达模式的组织可以进一步验证抗体的特异性。病理学家也可以为抗体染色的特异性提供宝贵的信息，特别是在罕见临床样本或非典型标记物的情况下，伪染色可能更难识别。虽然我们在这里概述了mIHC/mIF的抗体验证，但同行们前面的研究提供了更深入和集中的讨论。
 

影响抗体性能的另一个要考虑的因素是组织自荧光，其影响取决于组织类型、疾病状态、样品制备和固定方法等不同而可能存在很大差异。自荧光可显著影响标记的可视化，尤其是如果这些标记未与具有较高信号产率的荧光或荧光通道配对。因此，即使抗体的靶特异性得到验证，其有效使用也将取决于每个组织中预期的信号与组织自荧光相比，尤其是当标记无法放大时。虽然没有标准的自荧光控制或消除方法，我们提供了将常见内源性荧光团的信号最小化的策略（表二）。
 

我们这里讨论的mIHC/mIF检测包括采用一次性同时全套抗体染色（all in one）或一次单个抗体但循环染色（cyclic）两种染色模式。一旦建立了所检测的生物标志物列表并完成了其对应抗体特异性验证，就有必要验证整个抗体组（整个抗体panel）。因为抗体之间可能存在交叉反应，或者抗体panel内荧光标记/barcode的光谱重叠都可能导致panel设计的调整（图3）。当需要对panel中的任何抗体进行抗原修复时，相同的抗原修复方法必须适用于panel中的所有抗体。因此，比较同一抗体在多重mIHC/mIF检测时整个panel中的特异性和其在单IHC/IF检测时抗体的特异性至关重要的。如果一个抗体在多重mIHC/mIF的特异性表现与其单IHC /IF的表现不同，则可能需要进行进一步调整（例如，优化染色或结合条件、使用替代抗体）。
 

最后，建议在动态范围内滴定抗体，以确定最佳信噪比，同时减少光谱重叠。初始抗体验证和多重检测的整个panel验证试验都应该在对照组织中进行，而且必须以与最终待检测样本相同的方式进行试验，使用对照组织而不是最终的待检测样本可以保留珍贵样本，以便使用经过充分验证的抗体组进行最终图像采集。使用细胞或组织微阵列（TMA）进行最佳抗体滴定的定量评估非常有用。TMA，尤其是多器官TMA，在一轮染色中就能验证多个组织的抗体特异性。对于使用Cyclic循环方法的，有必要验证组织形态和靶蛋白在每个染色/抗体剥离循环步骤中保持完整，这方面有许多验证方法，包括1）比较单IHC/IF试验和循环实验的抗体性能，2）改变抗体添加顺序，以及3）在多个循环后重新成像同一生物标志物。如果观察到抗体免疫原性丧失，我们建议将受影响的抗体在循环染色中的顺序提前（循环一开始就使用此抗体染色），或用不同的抗体克隆替代，或优化循环条件，使低亮度抗体在高亮度抗体的前面。
 

注释1. 避免使用含有醛类的固定剂一定程度可以减少自荧光，也可以使用含有去污剂的固定剂来溶解红细胞减少来自脂肪酸和脂褐素的自荧光。有其他固定剂可以减少来自胆红素和嗜酸性粒细胞颗粒的自荧光，但都不太可能适用于高内容成像；

注释2. 用硼氢化钠进行化学或物理淬火，在有光的情况下用双氧水进行预处理，应用

TrueView(https://www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/btn-2017-0117)，或过氧化物酶-二氨基联苯胺（DAB）染色反应减少来自嗜酸性粒细胞颗粒的自荧光注释；

注释3 .用苏丹黑B（Sudan Black B）、真黑（生物素）（TrueBlack (Biotium)）或苏丹黑B和3,3'二氨基苄基（3,3'- diaminobenzidine）遮盖；

注释4. 光照；

注释5. 使用具有设定的激发源和窄滤波器的显微镜；

注释6. 选择具有高激发率的荧光标记；

注释7. 用二级抗体或TSA试剂在高自体荧光通道中放大信号；

注释8. 使用图像采集后去除自荧光的算法，例如光谱分解、通道阈值设定和减去背景干扰。
 

目前基于荧光标记的多重荧光组织免疫mIF/mIHC是探测肿瘤微环境应用最广泛的技术，TLR信息专注于mIF/mIHC的相关技术，致力于将免疫染色（mIF/mIHC）、荧光图像采集和分析的自动化和智能化，研发用于mIF/mIHC的全自动免疫组化染色机（TR-Stainer）和荧光全切片扫描仪，其中TR-sWSI-5F荧光扫描仪是一款轻量入门级产品，具备快速5色扫描功能（蓝色DAPI、绿色FITC、黄色TRITC、红色Cy5、近红外Cy7），满足目前免疫荧光组化的绝大多数临床需求。而TR-sWSI-MF 的多光谱荧光扫描仪可以将多达15种颜色和自体荧光彼此得到很好的分离，从而使用户信心百倍地专注于量化真正发生的生物学相互作用，能够在整个切片上同时观察和测量组织的细胞，包括多种细胞表型。