视网膜母细胞瘤（RB）是一种儿童眼内肿瘤，如果不治疗，会导致完全失明，并在晚期严重时死亡，近年来科学家通过开发针对RB细胞的靶向治疗来拯救患儿的视力和生命。视网膜主要由甘油磷脂组成，进一步可分类为磷脂（PE）和磷脂酰胆碱（PC）。用质谱成像技术（DESI MS）进行脂质成像检测是精确测量组织代谢产物和研究正常和癌变组织之间脂质变化的强有力的手段之一。基于DESI MS的脂质成像有助于视网膜疾病的研究，本篇文章主要以视网膜母细胞瘤（RB）作为研究对象，通过DESI-MS和免疫组学等技术，更深入地探究了NCL-APT核糖核酸酶适体对RB的调节治疗作用。
 

Kamalnayan Bajaj视力和眼科研究的Subramanian Krishnakumar教授在Molecular Therapy—Nucleic Acids发表的题为 “Nucleolin-aptamer therapy in retinoblastoma: molecular changes and mass spectrometry–based imaging ”（IF：11.454）的研究成果，通过DESI-MS成像技术、流式细胞术、qPCR、免疫组织化学、免疫印迹分析等技术，发现了核仁适体(NCL-APT)治疗RB特征，探究了NCL-APT调节RB机理，描绘了NCL-APT的DESI-MS脂质成像图谱，为NCL-APT的RB靶向治疗提供了理论依据。
 

1. RB中NCL的表达和NCL-APT的摄取

通过qPCR、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析RB肿瘤样本的NCL，发现RB细胞系Y79和WERI-Rb1和RB肿瘤细胞质中的NCL均显著上调。RB肿瘤细胞质和细胞表面的NCL水平升高，可有助于摄取RB肿瘤细胞中的NCL-APT。NCL-APT周期变化中，WERI-Rb1的G0-G1期增加，Y79的S期停滞。表明NCL在RB细胞和细胞系中差异表达，NCL-APT产生周期性变化（图1）。

图1 核仁素在RB肿瘤样本和细胞系中的表达

2. NCL-APT调节RB中的致癌miRNA

作者研究NCL-APT对RB的miRNA表达影响。通过微阵列分析，显示miRNA显著下调。NCL-APT处理后miRNA仍下调，qPCR在WERI-Rb1细胞中作用显著。说明miRNA谱中其他下调的miRNA表达变化也得到了验证（图2）。

 图2 NCL-APT对miRNA表达的影响

3. NCL-APT在体外和体内干扰RB：对miRNA、凋亡蛋白的影响

作者采用MTT研究RB、MIO-M1细胞系中NCL-APT生长和增殖。但细胞分裂的抑制导致细胞毒性，使RB细胞系的生存能力降低。通过RB和MIO-M1细胞系的细胞活力测试，证实了NCL-APT活性的特异性（图3）。

图3 NCL-APT对细胞增殖的影响

NCL-APT和LNA-NCL-APT在Y79异种移植小鼠的肿瘤部位附近皮下（皮下）治疗，显示肿瘤生长减少。说明不同治疗中切除的肿瘤大小差异明显（图4）。

图4 NCL-APT和LNA-NCL-APT的Y79异种移植物模型

采用微阵列观察NCL-APT处理的miRNA，发现miRNA在异种移植的肿瘤组织中被下调。表明NCL-APT对miRNA的影响导致肿瘤发生变化。实验通过正常裸鼠血清miRNA与Y79异种移植小鼠血清相比，显示miR-18a和miR-19b-1表达水平升高。NCL-APT皮下注射和LNA-NCL-APT腹腔注射组比较发现，所有治疗组中miR-18a表达受影响程度相似。免疫印迹分析显示，不同模式下FOXM1表达不同，但表达均下调。说明体外和体内NCL-APT治疗对RB生长的抑制是由mRNA、致癌miRNA和凋亡标志物进行整合调节介导的（图5）。

图5 Y79异种移植物上NCL-APT和

LNA-NCL-APT治疗后的分子变化

4. LNA-NCL-APT介导的凋亡标志物变化和细胞因子水平：整合体分析

LNA-NCL-APT处理的异种移植物中肿瘤凋亡蛋白和细胞因子发生变化。蛋白质阵列用PBS和LNA-NCL-APT处理的肿瘤组织研究凋亡标记物，显示外源性和内源性途径介质的显著差异。LNA-NCL-APT治疗中，趋化细胞因子和促有丝分裂细胞因子混合表达。LNA-NCL-APT腹腔注射治疗组织的IHC研究也显示细胞核PCNA表达水平下降。综合网络建模和分析，揭示了关键途径、基因等在NCL-APT治疗过程中的变化（图5）。

5. 异种移植组织的脂质谱分析

通过MS/MS和数据库检索，在DESI  MS中不同RB细胞系中观察到的高强度峰，与未处理组相比有显著差异（图6）。NCL-APT和LNA-NCL-APT治疗Y79异种移植物，分析皮下注射和腹腔注射的脂质质谱。肿瘤切片分析显示NCL-APT皮下注射的脂质强度降低，少数组织区域变化不明显（图7）。说明脂质水平的变化与适体有关，因为脂质合成的抑制或水平的降低直接影响细胞增殖。

图6 RB细胞系DESI MS成像

图7 NCL-APT和LNA-NCL-APT体内评估后PC水平的变化

通过免疫组学、质谱成像（DESI-MS）等技术，探究NCL-APT对视网膜母细胞瘤（RB）的表达和治疗。通过体外、体内NCL-APT对RB的影响，说明通过调节mRNA、致癌miRNA和凋亡标志物可抑制RB生长。脂质合成的抑制或水平的降低也直接影响RB的细胞增殖。同时，也进一步证实了NCL-APT治疗RB的有效性，也为RB的靶向治疗提供新思路。

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