目前，100%的病死率和病毒株的交叉感染使ASFV对社会的危害不断扩大。由于缺乏有效的商业疫苗，早期发现是遏制ASFV感染的最有效手段。
近期，山东师范大学在Biosensors and Bioelectronics发表了一篇《Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor》，该文章报告了一个基于CRISPR-Cas12a系统结合石墨烯场效应晶体管传感器的级联检测平台。
CRISPR-Cas12a级联平台的工作原理是基于RNA导向的DNA切割机制，通过选择性识别和切割特定的DNA序列，实现基因组的精确编辑。具体来说，在缺乏目标DNA的情况下，crRNA与Cas12a结合形成RNP。当crRNA识别目标DNA时，CRISPR-Cas12a的非特异性DNA切割活性被激活。
为了提高信号产生的效率，该平台采用了特殊的报告探针(RP)设计，由靠近石墨烯的6T和远离石墨烯的12U组成。这种设计使得如果一个脱氧核糖核苷酸被降解，至少有12个核苷酸会从石墨烯表面分离，显著提高信号产生效率。然而，该级联平台中的RP被固定在石墨烯表面，替代传统RP传感器通常分散在溶液系统中，这使得RP可以被激活的CRISPR-Cas12a更强烈地降解。     另外，这个平台还采用了ASFV P72基因中的10个crRNA特异性位点进行优化，以实现对ASFV更灵敏的检测。这些crRNA可以识别不同的位点，并激活Cas12a蛋白的剪切活性。通过在单个长靶上设置多个可以识别不同位点的crRNA，可以显著提高靶向Cas12a蛋白的激活效率。实验结果表明，Real-time荧光检测限为100 fM，灵敏度不足以实现ASFV病毒检测的临床应用。因此，探索如何使CRISPR-Cas12a系统对ASFV检测更加灵敏是必要的，并成为研究热点。
接着，作者对不同条件下的电导率进行测试，实验表明：石墨烯的电导率对外源掺杂敏感，经PBASE处理的石墨烯与RP/PBASE处理的石墨烯差异较大，使得实验结果更容易识别。    
  紧接着，作者测试了该平台的检测灵敏度与特异性，发现ASFV-P72基因在0.1 aM ~ 100 aM浓度范围内通过级联平台进行检测，成功检测到浓度低至0.5 aM的靶标，高于Real-time PCR的最低检测限10aM。且除ASFV外，所有病毒均引起狄拉克斑点向左移动，显示了级联平台的特异性。    
 
最后，作者对12例ASFV阳性样本和4例阴性样本进行传感器检测，阳性样本出现高强度右移特征响应，表明平台具有良好可靠性；阴性样本出现左移狄拉克点变化响应，表明平台具有良好的特异性。与已发表的研究成果相比，该平台对ASFV临床样本的检测时间最短，灵敏度最高。采用4个ASFV模拟样本进行分型试验，当模拟样品中仅存在P72基因时，添加新的crRNA不会改变斜率；当存在CD2V基因时，添加crRNA-CD2V会增加斜率；同样，当存在MGF基因时，添加crRNA-MGF也会导致斜率增大。通过观察特定应变类型的crRNA加入后斜率是否发生变化，成功进行了应变分型。    
   
点评：该级联平台可在30分钟内检测到低至0.5 aM的ASFV，并在单一检测系统中实现ASFV野生株和疫苗株的分型。对16份临床样本的评价证明，该平台与金标准Real-time PCR方法相比，灵敏度、特异性和分型方面具有突出的优势。该级联平台结合CRISPR/Cas12a的高特异性和石墨烯场效应晶体管的双极电场效应，与已发表的研究成果相比，本文提出的传感器对ASFV临床样本的检测时间最短，灵敏度最高，有望在DNA疾病检测领域实现临床应用，为多品系疾病分型提供新的方向。    

文章来源：Wang H, Sun Y, Zhou Y, et al. Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 2023;240:115637. doi:10.1016/j.bios.2023.115637