今天，给大家分享3月号发布的一篇新文章

iScience杂志（影响因子5.08）

《Biomimetic proteolipid vesicles for reverting GPI deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria》
这项研究旨在探索一种新的纳米囊泡载体，使用微流体技术将人体膜蛋白与合成磷脂在Y型芯片上制备为新型仿生蛋白膜囊泡（BPLVs），用于在恢复阵发性夜间血红蛋白尿（PHN））患者特定细胞中释放缺失的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白。研究结果表明，BPLVs可成功地递送GPI-锚定蛋白到缺失的PNH细胞中，并且这些细胞对补体介导的溶解表现出增强的抵抗力。通过使用PE-rhodamine标记的BPLVs，研究人员观察到红细胞和外周血单核细胞（PBMCs）对BPLVs的优异摄取能力，且PBMCs显示出更强的摄取能力。此外，研究人员还发现，BPLVs可提高细胞对补体介导溶解的抵抗力，尤其是PNH细胞。总体而言，这项研究为治疗PNH相关症状提供了一种创新的方法，BPLV 可作为有效的纳米载体，将蛋白质转移到目标细胞，以恢复PNH病的蛋白质缺乏。

（技术线路图）

脂质纳米颗粒是药物递送的新领域，因为它们成功地克服了药物递送的常见问题，如生物利用度低、半衰期短、药物不稳定、可能产生副作用以及缺乏靶向递送等。脂质纳米颗粒可采用不同的技术制造，如薄膜水合、超临界流体工艺或微流体方法。在微流控方案中，乙醇和水相会在微通道内混合，如果工艺参数（如流速和流速比）优化得当，就能获得单层单分散纳米颗粒。与其他技术相比，微流控方法还具有放大可行性、更高的封装效率和出色的批次间可重复性，以及长期悬浮的稳定性。脂质纳米载体通常显示出较低的全身毒性，可用于配制注射系统，这一点已在几种封装药物的商业制剂中得到证实，如抗肿瘤分子、抗生素、抗真菌药物或麻醉剂，以及核酸或 mRNA 疫苗。

蛋白脂纳米载体是药物递送领域的一项新技术，通过在合成脂质纳米载体中整合白细胞衍生的膜蛋白而获得，类似于白细胞的生理活动，如细胞粘附和炎症调节。在体外和体内模型中，这些纳米载体在减少中性粒细胞浸润和促进炎症消退方面具有巨大潜力。

在该文献中，作者介绍了使用锐讯生物科技有限公司生产的NanoGenerator Flex M微流控设备和Y型芯片，配制仿生蛋白脂囊泡BPLVs，作者首先优化了 BPLV 组装的微流控条件，并将合成脂质和从健康供体外周血单核细胞（PBMC）获得的膜蛋白混合在一起。随后，我们对功能化 BPLV 的大小、形态、表面电荷和细胞毒性进行了表征，并在健康和病理人类原代细胞上对其治疗 PNH 的潜力进行了体外测试。

（仿生蛋白脂囊（BPLV）的表征）

BPLV 的物理表征方法是：

（A）动态光散射（DLS）分析，显示出具有负 zeta 电位的均匀群体（多分散指数，PDI），这是细胞膜相互作用的最佳状态；

（B）Nanosight 确认了颗粒大小的均匀分布，并获得了颗粒浓度。数据以平均值 G 标准差 (SD) 表示。

  (C)  透射电子显微镜还研究了 BPLV 的形态，并使用磷钨酸溶液（2% w/v）对脂质层进行染色，从而观察到空的 BPLV（左图）和负载的 BPLV（右图）中的单脂质层。

流式细胞术研究了 BPLV 的表面蛋白表达，首先根据同时存在的罗丹明标记磷脂和人类膜蛋白（CD3）对颗粒进行了鉴定。计算了这些颗粒上 Flaer+ 、CD33+ 、CD14+ 、CD45+ 和 HLA-DR+ 囊泡的百分比，并通过除以染色样本的 MFI/未染色对照的 MFI，计算了中位荧光强度（MFI）倍数变化。

锐讯NanoGenerator Flex M微流控系统配备了一个内径为 600 毫米（总长度为 10 毫米）的 Y 型交错人字形微搅拌器芯片，流速设定为 4 mL/min，乙醇中的总脂质浓度为 17.5 mg/mL（乙醇/水相比例为 1:2），最终脂质与蛋白质的比例为 1:35。具体而言，有机相由 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和胆固醇组成。在脂质混合物中加入标记的 PE-罗丹明（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-利萨明罗丹明 B 磺酰）作为 BPLV 红色示踪剂，浓度为脂质相总量的 0.5%。水相加有从健康和 PNH PBMCs 提取的膜蛋白总提取物。然后将试剂装入 15 mL 试管并连接到微流控电路，直接施加预设压力，以 4 mL/min 的总恒定流速将溶液推入混合芯片。然后，将混合溶液收集到端接芯片的 15 mL 清洁试管中。作者测试了低于或高于 4 mL/min 的流速，但得到的囊泡粒径分布更大。作者选择的蛋白质与脂质的比例（1:35）确保了极佳的蛋白质负载。因此，他们的配方显示出巨大的放大潜力，同时具有良好的负载和产品稳定性，这对大规模体外和体内研究极为重要。

（红细胞（RBC）对仿生蛋白脂囊（BPLV）的吸收）

通过共聚焦显微镜研究了囊泡的吸收情况，BPLV 被标记为 PE 罗丹明示踪剂（红色信号），而 RBC 膜则被标记为亲脂性染料（DiO 亲脂性示踪剂，绿色信号）。吸收了 BPLV 的红细胞显示出强烈的红色或合并的橙色信号。

(A) 亲脂性示踪剂 DiO 染色 RBC 膜（绿色信号），吸收了 PE 罗丹明 BPLV 的 RBC 显示红色或橙色（合并）信号。更高倍放大（10 倍变焦）的 RBC，用于 BPLV 吸收的 PE 通道（B）、用于膜染色的 FITC 通道（D）和合并通道（C）。

PNH是BMF综合征中的一种良性克隆性血液病，是由参与GPI锚生物合成的PIGA基因发生体细胞突变引起的，其特征是需要GPI锚才能正确定位在细胞表面的蛋白质（包括内源性补体调节蛋白CD55和CD59）无法在膜上锚定。PNH 的症状继发于补体诱导的细胞溶解，如血管内红细胞溶解和血栓形成，从而导致贫血和血栓事件。血栓形成是 PNH 患者死亡的主要原因，占死亡人数的 40% 以上，可发生在任何部位，最常见的是肝静脉（Budd-Chiari 综合征，占患者的 7.5-25%）和脑静脉。PNH 症状可通过补体抑制剂进行药物治疗，以减少补体对 GPI 缺乏细胞的激活，从而改善其存活率。然而，PNH 克隆会积聚到外周血中，并在补体最大激活时（如细菌感染时）被溶解，从而超过补体抑制作用，导致突破性溶血，尤其是在新型补体抑制剂（如 ravulizu- mab）治疗下。因此，需要采用不同的药理学方法来改善 PNH 患者的临床治疗。在这项研究中，作者配制了携带 GPI-锚地定蛋白的 BPLVs，用于一种创新的治疗方法，以获得一种新的蛋白质递送系统来恢复 PNH 细胞的 GPI 缺乏。

本文提供了一种治疗 PNH 相关症状的创新方法，即用由人类膜蛋白和合成磷脂组成的BPLVs作为蛋白质递送系统，在不改变细胞基因组的情况下向 PNH 细胞释放整套 GPI-anchored 蛋白质。这种方法是 PNH 领域的一项创新，这种利用微流体技术将复杂蛋白质提取物加入脂质囊泡而制成的蛋白质递送平台已被用于向 PNH 细胞递送缺乏的蛋白质。制备的囊泡是仿生的，没有毒性，与细胞膜的亲和力极强，因此能很好地吸收和输送蛋白质，从而有效地恢复 PNH 克隆细胞的蛋白质缺乏症。这项研究成果开辟了新的治疗方案，因为细胞表型的改变无需引入 DNA 的变化，从而克服了与使用病毒载体或其他基因组修饰剂有关的所有技术问题。这些改变很可能是短暂的，因为它们依赖于细胞的寿命，没有在细胞基因组中引入永久性改变。这可能是一个不利因素，因为患者可能需要长时间的治疗；反之，通过剂量和时间调节，与治疗相关的不良反应可能会得到更好的控制。这个系统还可进一步用于在纳米载体中加入嵌合受体或其他重组蛋白，以实现先进的给药功能，治疗由特定蛋白缺乏引起的各种疾病。尽管研究结果非常令人鼓舞，但还需要在更多的体外和体内研究中进一步验证。


原文：https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109021