InnoScan文献快讯—
     DNA双链断裂修复能力快速评估技术 NEXT-SPOT      


       DNA 双链断裂 (DSB) 被认为是最有害的 DNA 损伤类型，是突变和染色体畸变的有效诱导物，可能导致遗传性疾病和癌症。 为了维持基因组稳定，人类细胞需要通过触发高度复杂的分子反应信号网络（以多种修复途径为特征）来快速启动和调节 DSB 修复。
       首先，非同源末端连接（NHEJ）途径可在整个细胞周期中保持活跃，直接结合两个断裂末端，而不需要参考任何模板。 由于这些原因，它被认为是所有类型 DSB 的主要修复机制。 相比之下，同源重组 (HR) 被认为是无错误的途径，也是在细胞周期 G2/S 期（此时有模板材料可用）处理 DSB 的最佳选择。 同源重组首先切除 DNA 末端，形成侵入同源 DNA 区域的单链区域。 然后，几个竞争途径完成同源重组过程，并涉及 DNA 合成。 单链退火 (SSA) 有时被描述为同源重组的子途径，因为它依赖于同源重组相关机制及其对同源性的依赖，它也涉及遗传物质的删除，被认为具有诱变性。
      当非同源末端连接禁用时，另一种末端连接途径（alt-EJ，也称为微同源介导的末端连接）起作用。 它以一种容易出错的方式连接两个 DNA 末端，因为它通常意味着修复序列的微缺失。 不仅 HR，alt-EJ 和 SSA 都需要切除 DNA 末端以生成不同大小的单链 DNA (ssDNA) 尾部。 ssDNA 尾部的长度影响修复机制的选择， alt-EJ  2-20 bp，SSA 超过 50 bp，HR 大约 100 bp。 DNA 聚合酶在 DSB 修复中发挥重要作用，因为它们可以填补空缺以促进 DNA 链连接或添加核苷酸以产生同源性。
      评估细胞DNA双链断裂修复能力对于了解疾病侵袭和治疗反应至关重要。传统评估方法通常耗时且复杂。为解决该挑战，研究人员开发了NEXT-SPOT技术。 NEXT-SPOT技术在DNA修复评估领域具有几个关键优势。它提供了一种快速而高效的DSB修复能力评估方法，使研究人员能够在不到2小时内获得关于修复途径的定性和定量信息。通过表征HR-like链侵入、DNA末端连接和合成活性，NEXT-SPOT提供了对细胞修复机制的全面分析。该技术能够检测细胞在暴露于DNA损伤诱导剂和抑制剂后修复活性的变化，使其成为预测治疗结果和指导个性化治疗的宝贵工具。  
图 1. 生物芯片上的 NEXT-SPOT 检测原理概述。 每个生物芯片由14个 反应区组成，每反应区含两种固定在芯片的底物，超螺旋质粒（SC-质粒）和线性质粒（Lin-质粒），每种底物各两个点位。 修复反应发生在固定底物和 Cy3 标记的线性质粒 (Cy3-Lin-plasmid)、生物素-dCTP 和添加的细胞裂解物之间。 然后，生物素标记的 dCTP 通过 Cy5-链霉亲和素显示 或者使用 Cy5-dCTP 直标。 使用InnoScan710AL 双色激光荧光扫描仪（激发波长：532 和 635 nm）对信号进行量化。 SC-质粒、Lin-质粒、Syn-SC ：SC-质粒上的DNA合成、Syn-Li：Lin-质粒上的DNA合成。
 
NEXT-SPOT实验生物芯片制备过程包括以下步骤。
 
1.     制备超螺旋质粒（SC-plasmid）和线性质粒（Lin-plasmid）。
 
超螺旋 pBlueScript 质粒（SC-质粒；Stratagene）的制备如 Millau 等人所述（Millau, J.-F. et al. A microarray to measure repair of damaged plasmids by cell lysates. Lab Chip 8, 1713 (2008）。 线性质粒（Lin-质粒）是通过按照制造商方案（New England Biolabs）使用限制性内切酶AflIII消化pBlueScript质粒获得。 用异丙醇/乙酸钠沉淀 Lin-质粒，并以所需浓度重悬于分子生物级水中。
Cy3 标记的 线性质粒 (Cy3-Lin-质粒) 是使用 Label IT® Tracker™ 试剂盒 (Mirus) 按照供应商的说明获得。 简而言之，将 100 µg 线性质粒与 50 µL Label IT® Reagent 和 100 µL 标记缓冲液在 37 °C 下孵育 2 小时。 然后，Cy3-Lin-质粒在乙醇/氯化钠中沉淀，用分子生物级水稀释并储存在- 80°C。
使用 NanoDrop™ 分光光度计对 Cy3-Lin-质粒进行定量； 标记率是根据制造商的说明计算。 据估计，平均每 200 个碱基对约有一个标签。
 
2.     制作载玻片芯片：
 
使用生物芯片点样系统（SciFlexarrayer，Scienion 德国）将 SC-质粒和 Lin-质粒点制在涂层载玻片（Nexterion® H，Schott）特定位置。 形成 14 个相同反应区，每个反应区含 4 个未标记质粒的点（2 个 SC 质粒和 2 个 Lin 质粒）。 按照载玻片制造商描述的过程进行质粒固定和片基灭活。 将载玻片芯片真空 - 20 °C储存。
 
 
3.     制备反应室：
使用HybriWell™ Sealing System在生物芯片上形成14个相同的反应室。
每个反应室将用于进行修复反应，评估细胞裂解液中修复蛋白与固定质粒的相互作用。
 
 
4.     修复反应
使用 NEXT‑SPOT 进行 DSB 修复分析。 HybriWell™ 密封系统（Grace Bio-Labs）应用于载玻片芯片上，形成 14 个相同的反应室。 每种裂解物均在 2 种不同的终蛋白质浓度下进行测试。 为此，混合物含有 (i) 2 ng/μL Cy3 标记的线性 DSB 质粒 (Cy3-Lin-plas-mid)、(ii) 0.25 µM 生物素-dCTP、0.25 µM 其他 3 种非标记 dNTP , (iii) 80 mM KCl、20 mM Tris–HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、2 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、1 mM ATP、0.05 mg/mL 肌酸磷酸激酶、10 mM 磷酸肌酸，总反应体积为 每孔 12 µL。 修复反应在30℃下进行1小时。 然后用 Milli-Q 水润洗载玻片两次。 随后通过与 0.1 µg/mL 链霉亲和素-Cy5 溶液在 30 °C 下孵育 30 分钟来标记生物素-dCTP。 用 Milli-Q 水润洗载玻片两次并干燥。 每个样品在两个反应区进行测试（技术重复）。 或者，使用 Cy5-dCTP 直接标记，而不使用生物素-dCTP。
 
5.     信号检测和分析
 
使用扫描仪（Innopsys 的 Innoscan 710AL 和 Mapix 软件）以 532 nm (Cy3) 和 635 nm (Cy5)为激发光对荧光信号进行量化。结果以 4 个重复的荧光强度平均值计算。每个样品均由 4 个值表征，分别为 HR 样链侵入、NHEJ 介导的末端连接、SC 质粒上的 DNA 合成 (Syn-SC) 和 Lin 质粒上的 DNA 合成 (Syn-Lin)。
 

      NEXT-SPOT技术代表了DNA修复能力评估领域的重大进展。通过将创新的生物芯片技术与激光荧光扫描相结合，NEXT-SPOT提供了一种快速、可靠和全面的方法，用于评估DSB修复途径。该技术提供详细的细胞修复机制见解，有望促进个性化医学，并在肿瘤学领域和其他领域改善患者预后。
 

文献原文链接： https://doi.org/10.1038/s41598-022-23819-0