引言
近年来，科学家发现非编码RNA（ncRNA）在细胞中扮演着重要角色。ncRNA的失调与癌症、神经退行性疾病等多种疾病有关。因此，开发针对ncRNA的小分子药物成为药物研发的新方向。然而，RNA的结构复杂且多变，这使得它成为药物靶点的难度较大。传统的药物筛选方法在RNA靶点上的应用效果有限，而小分子微阵列（SMM）技术为RNA靶向药物的发现提供了新的可能性。

来自俄亥俄州立大学等单位的研究人员利用小分子微阵列（SMM）技术，筛选并鉴定了Methanobrevibacter smithii（Msm）RNase P RNA（RPR）的抑制剂。RNase P是一种广泛存在于生物体内的核酶，负责前体tRNA的5'端成熟。由于它在不同生物中的结构多样性和低拷贝数，RNase P成为潜在的药物靶点。通过SMM筛选，研究人员发现了多个能够特异性结合Msm RPR的小分子，并进一步验证了其中一种二芳基哌啶类化合物（M1）的抑制活性。

小分子微阵列（SMM）筛选技术
SMM技术是一种高通量筛选方法，能够快速鉴定与目标RNA结合的小分子。在这项研究中，研究人员使用了Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer（Arrayjet, Roslin, UK）来制备微阵列。该设备能够将7300种化合物精确打印在化学修饰的玻璃片上，形成高密度微阵列。此外，研究人员还使用了InnoScan 1100 AL荧光扫描仪（Innopsys, Carbonne, France）来检测荧光信号。

具体实验步骤如下：
微阵列制备：使用Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer将7300种化合物打印在载玻璃片上。
RNA标记：Msm RPR通过5'端延伸的DNA寡核苷酸与Cy5荧光标记的DNA寡核苷酸互补结合，形成荧光标记的Msm RPR。
筛选过程：将荧光标记的Msm RPR与微阵列上的小分子孵育，使用InnoScan 1100 AL扫描仪进行荧光成像，检测小分子与RNA的结合情况。
数据分析：通过计算每个点的荧光强度，筛选出与Msm RPR特异性结合的小分子。筛选标准包括信噪比（SNR）大于0、Z-score大于3、重复点的变异系数（CV）小于100等。
 
InnoScan 1100 AL荧光扫描仪在这项研究中发挥了关键作用。它的高分辨率和灵敏度使得研究人员能够准确检测微阵列上每个点的荧光信号，从而筛选出与Msm RPR结合的小分子。通过该仪器，研究人员在400 mM Mg²⁺条件下筛选出48个与Msm RPR特异性结合的小分子，命中率为0.7%（图1C）。在10 mM Mg²⁺条件下，筛选出58个结合分子，命中率为0.8%。值得注意的是，两种条件下仅有8个化合物重叠，表明不同Mg²⁺浓度下Msm RPR的构象变化影响了小分子的结合。 （A） 带有5'和3'延伸的Msm RPR的二级结构（文中称为Msm RPR）。在该图中，P表示RPR中按转录顺序标记的配对区域，L表示环状区域。使用与5'延伸互补的Cy5标记的DNA寡核苷酸生成荧光标记的Msm RPR，用于后续的SMM筛选。缩写：PC，阳性对照；NC，阴性对照。
（B） Mg²⁺对Msm RPR前体tRNA加工活性的影响。变性聚丙烯酰胺凝胶[10%（w/v）/7 M尿素]显示，在10 mM或400 mM Mg²⁺存在下，Msm RPR对5'-[32P]标记的Thermus thermophilus（Tth）前体tRNA⁶ˡʸ的切割情况，反应在37°C下进行1小时。
（C） Z-score散点图，比较在400 mM或10 mM Mg²⁺条件下的SMM筛选结果。蓝色数据点表示在400 mM Mg²⁺条件下优先结合的小分子。红色虚线对应Z-score值为3，Z-score大于3的小分子被认为是选择性结合物。

为了进一步验证筛选出的小分子与Msm RPR的结合亲和力，研究人员使用了Plexera公司的表面等离子体共振成像（SPRi）技术。SPRi技术是一种无标记的光学传感技术，能够实时监测分子间的相互作用。在这项研究中，研究人员将M1及其类似物固定在SPRi芯片上，通过流动相中的Msm RPR与芯片上的小分子结合，检测结合过程中的折射率变化，从而计算出结合亲和力（K_D(app)）。

具体实验步骤如下：
芯片制备：使用Plexera公司的SPRi芯片，将M1及其类似物以8×8阵列格式打印在芯片表面。
结合实验：将折叠好的Msm RPR注入流动池，进行300秒的结合和300秒的解离过程，流速为2 μL/s。
数据分析：通过Plexera SPR Data Analysis软件分析结合曲线，计算出M1及其类似物与Msm RPR的结合亲和力。

通过SPRi技术，研究人员确定了M1与Msm RPR的结合亲和力（K_D(app)）为8 ± 3 μM（图3C, D），进一步验证了M1的抑制活性。 （C） 用于测定M1syn与Msm RPR结合亲和力的代表性表面等离子体共振成像（SPRI）传感图。将浓度递增的Msm RPR（0.625–20 μM）流过M1syn固定的芯片，获得SPRI传感图和相应的结合曲线（D）三次独立试验的数据用于计算报告的结合亲和力（K_D(app)）值的平均值和标准偏差。
 
M1的抑制活性验证
在筛选出的48个结合分子中，研究人员进一步验证了M1的抑制活性。M1是一种二芳基哌啶类化合物，具有较好的药物特性，包括三个芳环、两个氢键供体、一个氢键受体和401 Da的分子量。通过前体tRNA切割实验，研究人员发现M1能够抑制Msm RPR的活性，抑制常数（Ki）为17 ± 1 μM。此外，SPRi实验进一步验证了M1与Msm RPR的结合亲和力（K_D(app)为8 ± 3 μM）。

结构-活性关系（SAR）分析
为了进一步理解M1的抑制机制，研究人员合成了多个M1类似物，并进行了结构-活性关系分析。结果表明，M1的核心结构中的甲基和哌啶环上的氮原子对其抑制活性至关重要。例如，去除甲基（M1-desMe）导致结合亲和力下降4-5倍，抑制活性下降6倍。此外，哌啶环上的氮原子修饰（如M1-desMe-N-allyl）进一步降低了抑制活性。这些结果表明，M1的结构特征与其抑制活性密切相关。

M1的选择性分析
为了验证M1的选择性，研究人员测试了M1及其类似物对另一种结构相似的古菌RNase P RNA（Pfu RPR）的抑制效果。结果表明，M1及其类似物对Pfu RPR没有明显的抑制作用，进一步证明了M1对Msm RPR的选择性。这一选择性可能与Msm RPR和Pfu RPR在结构上的细微差异有关，尤其是Msm RPR的AU含量较高，可能形成了适合M1结合的构象。

讨论与展望
这项研究展示了SMM技术在RNA靶向药物筛选中的应用潜力。通过SMM筛选，研究人员成功鉴定了Msm RPR的特异性抑制剂M1，并通过结构-活性关系分析揭示了其抑制机制。M1的选择性抑制为开发针对特定RNA靶点的小分子药物提供了新的思路。

未来的研究方向包括进一步优化M1的结构以提高其抑制活性，并探索其在减少牛瘤胃中甲烷排放中的应用。此外，M1的类似物可能被用于开发针对人类RNase P RNA（H1 RNA）的抑制剂，H1 RNA的失调与非小细胞肺癌等多种疾病相关。通过SMM技术筛选出的RNA靶向小分子有望为这些疾病的治疗提供新的药物候选物。

文献链接：
Sidharthan, V., et al., Use of a small molecule microarray screen to identify inhibitors of the catalytic RNA subunit of Methanobrevibacter smithii RNase P. Nucleic Acids Res, 2025. 53(1).