逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的具体操作步骤
2024-08-21 来源:本站 点击次数:1772
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR操作步骤：
一、RNA逆转录cDNA（反应体系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（体积即上一步骤计算出来的）
3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆转录试剂
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、设置仪器，按照说明书设置
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆转录：70℃ 5min
3、终止：4℃
附加：cDNA可以跑电泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看这个是几乘的）混匀，跑电泳，marker用2000的取6ul左右胶板的制作，后面有说明。
四、PCR cDNA扩增目的基因（反应体系是20ul，不够用无菌水补齐）
下面的实验用高压过的枪头和普通高压过的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中冻存，使用之前离心，甩下来即可。量大的话可以先加样配比，即把所需要的试剂总量计算出后，取出放在ep管中。）
1、加样：①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水总计9ul
2、混匀：小离心机甩一下即可
3、放入PCR仪：PCR仪事先设定条件，反应条件根据mix说明书来设定
4、PCR产物保存：一般在4℃冰箱保存，长时间不用可-20℃冻存。
五、配胶和跑胶:
1、配胶: （水平胶；琼脂糖凝胶）要带手套，TAE有毒。
小胶板8孔的 TAE 25ml 琼脂糖 0.25～0.30g
中胶板25孔的 TAE 50ml 琼脂糖 0.50～0.55g
步骤：称取BIOWEST AGAROSE（琼脂糖）放入配胶专用烧瓶→用配胶专用量筒量1×TAE倒入烧瓶→酒精灯加热(以看到冒泡为准)→将沸腾的液体转移到EB污染区的烧瓶中→加入EB或EB替代（观察颜色不是很深即可，一般小胶板3滴左右）→插梳子→倒入电泳槽(倒胶从一个角倒入防止产生气泡)→待胶凝固30分钟左右拔出梳子进行跑胶(如不马上跑将胶放4℃冰箱保存,防止胶变干)。
2、跑胶:
（1）电泳缓冲液用1×TAE,一般跑5-8次胶后就要重新换电泳缓冲液。
（2）要让缓冲液没过胶。
（3）Marker标记染色体上一个可以被识别的区域，我们用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul单格加入。
步骤：取PCR产物（cDNA）8ul，加入单格上，接通电源，跑胶。（注意：跑胶方向是从负极到正极）,当loading Buffer跑到2/3时停止跑胶（大约40分钟），带手套取胶放在照相台上。
六、照相
注意事项：
1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol 用量
2、组织或细胞量过多，会引起DNA对RNA的污染
3、高蛋白、高脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆后须2-8℃，12000g离心5min去除不溶物，再进行下面操作，若上层有脂肪物，则也须去除。
4、热天提RNA，戴手套是必须的，手是Rnase的主要来源。
5、匀浆时，组织块不宜过大，先用组织剪将组织剪碎，然后再充分匀浆。
6、对实验器具进行处理。主要有以下几点，(1) 研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用。(2) 实验中使用的EP管，枪头等塑料制品，需要用DEPC水浸泡24小时后，经高温灭菌干燥使用。(3) 为了防止Rnase的污染，用DEPC水替代三蒸水进行溶液的配制。(4) RNA操作中使用专用的器械，有条件的也可以设置专用实验室。
7、外源性的RNase会污染玻璃、塑料制品、实验器械、及各种实验试剂。操作过程中，手套是最容易污染样品的，因此手套要勤换。实验人员说话过程中所带的唾液会降解样品，故需带口罩操作。在RNA整个提取过程中，实验人员熟练快速的完成整个RNA的提取，减少实验所用的时间。
RT-PCR操作步骤：
一、RNA逆转录cDNA（反应体系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（体积即上一步骤计算出来的）
3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆转录试剂
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、设置仪器，按照说明书设置
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆转录：70℃ 5min
3、终止：4℃
附加：cDNA可以跑电泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看这个是几乘的）混匀，跑电泳，marker用2000的取6ul左右胶板的制作，后面有说明。
四、PCR cDNA扩增目的基因（反应体系是20ul，不够用无菌水补齐）
下面的实验用高压过的枪头和普通高压过的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中冻存，使用之前离心，甩下来即可。量大的话可以先加样配比，即把所需要的试剂总量计算出后，取出放在ep管中。）
1、加样：①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水总计9ul
2、混匀：小离心机甩一下即可
3、放入PCR仪：PCR仪事先设定条件，反应条件根据mix说明书来设定
4、PCR产物保存：一般在4℃冰箱保存，长时间不用可-20℃冻存。
五、配胶和跑胶:
1、配胶: （水平胶；琼脂糖凝胶）要带手套，TAE有毒。
小胶板8孔的 TAE 25ml 琼脂糖 0.25～0.30g
中胶板25孔的 TAE 50ml 琼脂糖 0.50～0.55g
步骤：称取BIOWEST AGAROSE（琼脂糖）放入配胶专用烧瓶→用配胶专用量筒量1×TAE倒入烧瓶→酒精灯加热(以看到冒泡为准)→将沸腾的液体转移到EB污染区的烧瓶中→加入EB或EB替代（观察颜色不是很深即可，一般小胶板3滴左右）→插梳子→倒入电泳槽(倒胶从一个角倒入防止产生气泡)→待胶凝固30分钟左右拔出梳子进行跑胶(如不马上跑将胶放4℃冰箱保存,防止胶变干)。
2、跑胶:
（1）电泳缓冲液用1×TAE,一般跑5-8次胶后就要重新换电泳缓冲液。
（2）要让缓冲液没过胶。
（3）Marker标记染色体上一个可以被识别的区域，我们用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul单格加入。
步骤：取PCR产物（cDNA）8ul，加入单格上，接通电源，跑胶。（注意：跑胶方向是从负极到正极）,当loading Buffer跑到2/3时停止跑胶（大约40分钟），带手套取胶放在照相台上。
六、照相
注意事项：
1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol 用量
2、组织或细胞量过多，会引起DNA对RNA的污染
3、高蛋白、高脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆后须2-8℃，12000g离心5min去除不溶物，再进行下面操作，若上层有脂肪物，则也须去除。
4、热天提RNA，戴手套是必须的，手是Rnase的主要来源。
5、匀浆时，组织块不宜过大，先用组织剪将组织剪碎，然后再充分匀浆。
6、对实验器具进行处理。主要有以下几点，(1) 研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用。(2) 实验中使用的EP管，枪头等塑料制品，需要用DEPC水浸泡24小时后，经高温灭菌干燥使用。(3) 为了防止Rnase的污染，用DEPC水替代三蒸水进行溶液的配制。(4) RNA操作中使用专用的器械，有条件的也可以设置专用实验室。
7、外源性的RNase会污染玻璃、塑料制品、实验器械、及各种实验试剂。操作过程中，手套是最容易污染样品的，因此手套要勤换。实验人员说话过程中所带的唾液会降解样品，故需带口罩操作。在RNA整个提取过程中，实验人员熟练快速的完成整个RNA的提取，减少实验所用的时间。
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