细菌形态：

细菌可以呈现三种基本形状之一：球形（球菌）、杆状（芽孢杆菌）或弯曲（弧菌、螺菌）。例如，一些球菌会成对存在，大多数链球菌类似于一长串珠子，而葡萄球菌则形成随机团块（“葡萄球菌”这个名字来源于希腊语staphyle，意思是“葡萄簇”）。此外，一些球菌以方形或立方体团块形式出现。杆菌通常单独出现，但有些菌株会形成长链，例如棒状杆菌，经常以任意角度相互连接。有些杆菌的末端是尖的，而另一些杆菌的末端是方形的。还有些杆状杆弯曲成逗号形状通常被称为弧菌，包括引起霍乱的霍乱弧菌。其他形状的细菌包括弯曲的螺旋体，形成类似于开瓶器的螺旋体。
 

图二 革兰氏阳性与阴性的比较（图源网络）

 

02细菌污染现象

细菌在适宜的条件下会快速增殖，因此细菌污染的进程一般很快，有的在培养箱过夜便可观察到培养液浑浊，同时因为细菌的代谢产生酸性物质使培养液的pH下降变黄。在显微镜下，会发现细沙状/杆状/球状的黑点均匀密集分布，有的甚至会产生异样的气味。

下面让我们通过一些图片来进一步具象化细菌污染吧！

图三 左侧为正常培养基颜色，右侧为细菌污染后的培养基，可明显发现变黄、浑浊。（图源客户）


图四 细菌污染初期培养基粉红色，略带浑浊。（图源客户）


图五 细菌污染可能造成细胞增殖缓慢或形态上的改变（多角、多核等），细胞质中产生空泡、细胞不附着。（图源客户）


图六 细菌污染严重时，显微镜下观察呈细沙状，放大倍数仔细观察可以见黑点会存在均一的细菌形态如杆状、球状、弯曲等。（需要区别于血清沉淀，血清沉淀通常形态不一）

03 细菌污染的防治

细菌的克星：抗生素

又称为抗菌素，是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用，主要是针对“细菌有而人（或其他动植物）没有”的机制进行杀伤，包含四大作用机理，即：抑制细菌细胞壁合成，增强细菌细胞膜通透性，干扰细菌蛋白质合成以及抑制细菌核酸复制转录。



抗生素的作用具有选择性，不同抗生素对不同病原菌的作用不一样。对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱（抗菌谱）。仅对单一菌种或属有抗菌作用，这类抗生素称为窄谱抗菌素，如青霉素的抗菌谱主要包括革兰氏阳性菌和某些阴性球菌，链霉素的抗菌谱主要是部分革兰氏阴性杆菌。在细胞培养中，为了起到预防的作用我们常加入1%的青链双抗（C3420-0100），抗生素联合使用目的是减少细菌耐药性，扩大抗菌范围。但是双抗并不是营养体系，有研究证实抗生素会影响某些细胞的增殖和细胞代谢等，因此在无菌条件良好的情况下，无需添加。

图七 某些抗生素的抑菌原理^[1]

想“对症用药”需要菌种鉴定
可以提取细菌基因组DNA，通过PCR扩增测序之后，与GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在99%以上就可以认为是同一个种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。


在细胞培养过程中除了添加抗生素我们应该做好以下工作

污染后处理：

●及时丢弃发生污染的细胞

●对环境进行消杀，紫外线灭菌、消毒液擦拭培养箱、工作台等

●检查所有用过的相关试剂是否发生污染，条件允许的情况下可以开封新试剂使用

对于重要且污染相对较轻的细胞：可以考虑先用含有5%-10%的双抗的PBS进行多次清洗，再用含5%-10%的抗生素的培养基用药 24h-48h小时，换液使用含有2-3%的抗生素培养基培养24h，最后再换回常规的含1%双抗的培养液进行培养，期间要随时观察细胞的状态。但需要注意的是：一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除，另有研究表明，高浓度抗生素可能对细胞有负面影响。

预防大于处理：

在细胞实验过程中，我们不希望看到任何微生物污染的情况发生。为了避免浪费有限的精力和资源，应优先预防污染的发生。因此我们在细胞培养过程中需要遵循无菌技术的所有准则，包括无菌工作区、无菌试剂、良好的个人卫生和无菌处理等。当然，最最最重要的是我们要拥有足够且正确的知识和意识，才能够轻松应对细胞培养过程中发生的种种情形。

参考文献：
[1] Kapoor G, Saigal S, Elongavan A. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2017 Jul-Sep;33(3):300-305.
[2] Kadner, Robert J. Rogers, Kara. "bacteria". Encyclopedia Britannica, 15 Aug. 2024.