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DEEPscope在多光子显微镜在LFOV、深层和高分辨率成像中的应用

2024-11-05     来源:本站     点击次数:290

大规模神经元活动的体内成像在解开大脑电路的功能中起着举足轻重的作用。多光子显微镜作为深层组织成像的有力工具,在提升其成像速度、拓展视野以及增加成像深度等方面一直备受关注。不过,由于要避免在散射生物组织时出现热损伤的情况,所以随着成像深度不断增加,视野会呈现出指数级的缩减。

在此背景下,美国康奈尔大学Chris Xu教授团队提出了一系列创新举措,旨在对三光子显微镜进行优化,使其能够在双光子显微镜无法触及的深度实现大视场成像。凭借这些技术,可以在小鼠大脑最深的皮质层中,针对那些表达蛋白质钙传感器的转基因动物,以单细胞分辨率,在直径约为3.5毫米的视场内,对其神经元活动进行成像

该团队还进一步展示了多种成像成果,包括同时进行的大视场双光子和三光子成像、在小鼠大脑中的皮质下成像,以及针对成年斑马鱼的全脑成像。

研究背景
在许多生物领域,对完整组织进行大视场(LFOV)且具有高空间和时间分辨率的深度成像至关重要。它有助于深入了解生物组织的内部结构和功能,例如在神经科学中对大脑神经元活动的研究。

近年来,2PM技术有所进步,能实现一定体积的LFOV神经活动记录,如达到约的体积且帧率约为2Hz,但成像深度局限于皮质浅层。虽然3PM可对深层皮质层、亚板和皮层下区域成像,突破了2PM的深度限制,能提供2PM无法触及区域的光学通路。然而,为避免生物组织热损伤,3PM需要低激光重复率,这限制了每秒可成像的像素数量,导致其成像视场通常较小,如在一些研究中,成像视场局限在几百微米。

同时,在LFOV和深度成像中,荧光信号产生也是2PM和3PM技术面临的重大挑战。对于3PM来说,由于其依赖更高阶非线性激发,相比2PM更难以通过降低光学分辨率来增加成像通量以扩大视场。

DEEPscope显微镜设计
1、激发源
3PM激发源:采用非共线光学参量放大器(NOPA)作为核心部件,由放大器(Spirit)进行泵浦。其中心波长设定为1320nm,重复率约为2MHz,平均功率可达约2W,每个脉冲的能量约为1μJ。为实现自适应激发功能,搭配了电光调制器(EOM)。同时,使用两棱镜(SF11玻璃)压缩机来补偿光学系统中的正常色散。经过色散补偿后,在物镜下的脉冲持续时间约为60fs。

2PM激发源:选用锁模Ti:Sapphire激光,中心波长为 920nm,具有80MHz的高重复率,平均功率约为1.6W。同样配备EOM用于自适应激发,并且也使用两棱镜压缩机来补偿光学系统的正常色散。经过色散补偿后,在物镜下的脉冲持续时间约为90fs。

2、光束生成延迟线
主要作用是将1320nm的激光脉冲分裂为两个具有特定时间延迟的脉冲(光束),以此提高有效激光重复率。其结构是一个由四个一英寸介质镜和一个偏振分束器立方体(PBS)组成的环形。

PBS作为整个延迟线的输入和输出端口,通过调整位于PBS之前的半波片(HWP)来控制每个光束的功率分布。在环形结构内部,通过倾斜两个镜子来调整光束之间的角度分离,使它们在垂直于扫描方向的平面上收敛于多边形扫描仪。

为补偿光束之间的发散差异,在环内设置了一个8-f系统。最终在沿慢Y轴方向上创建了两个相距约3μm的共面焦点。

3、扫描系统
多边形扫描仪和相关配置
采用9-mm孔径多边形扫描仪和10-mm孔径振镜(galvo-mirror),通过两个定制扫描透镜()进行共轭。多边形扫描仪具有12个面,每个面的清晰孔径为17.5mm×9.5mm。

由于光束在每个面的边缘会发生截断,为确保在整个视场(FOV)内均匀传输,将多边形扫描的填充率设置为70%。采用42度峰-峰光学扫描角,能够实现3.23mm的线性扫描场。

该多边形扫描仪的旋转速度范围为7000-30000转/分钟(RPM),对应的线率为1.4kHz-6kHz。不同制造商还可提供更高转速的多边形扫描仪,如55000RPM,可能进一步提高扫描速度到11kHz线率。

远程聚焦模块
远程聚焦模块用于调节2P焦平面与3P焦平面之间的距离。在2P光束路径中,光线依次经过HWP和PBS,然后被引导到一个季度波片(QWP)和远程聚焦物镜(ROBJ)上。

QWP和ROBJ在经过一个小镜子(PF03-03-P01)和一个定制适配器(约20g总重量)反射后实现双程通过,且ROBJ的后孔径与成像物镜的后孔径共轭。该模块可实现不同焦平面位置的轴向分辨率调节。

4、信号采集
荧光和三次谐波产生(THG)信号通过成像物镜收集,然后立即被一个77mm×108mm的二向色分束器反射到一个定制设计的检测系统,以实现高收集效率。

另一个77mm×108mm的二向色镜将信号进一步分为两个通道:一个用于收集来自GCaMP6s的荧光信号,另一个用于收集THG信号。分别使用特定的一英寸光学滤波器520/70和 435/40对两个通道进行滤波。

信号最终由两个有效传感器面积为的GaAsP光电倍增管进行检测,该光电倍增管经过定制,去除了内置前置放大单元,以降低暗计数。在成像深度为900μm时,对3.5mm FOV的荧光成像检测效率约为3.5%,此检测效率是通过既定的经验模型计算得出,该模型基于大脑表面的荧光分布以及相关测量结果。
 

自适应激发和光束扫描方案
1、自适应激发
首先通过常规光栅扫描获取结构图像,然后利用高斯滤波器和中值滤波器去除图像中的尖锐特征。接着,选择结构图像中像素强度排名前80%的区域作为成像区域,通过这种方式有效地排除了血管阴影区域。

将选定的成像区域位置转换为数字时间序列,针对每个扫描线分别进行转换。然后将这些时间序列发送到任意波形发生器(AWG)。AWG由ScanImage的线触发信号触发,它控制普克尔斯盒),使得激光功率仅传输到视场中选定的区域。

对于3PM,使用一个AWG实现自适应激发。而对于2P/3P复用的情况,则需要使用两个AWG(PXI-5421和PXI-5412,National Instrument),以适应不同成像深度下的不同选定区域AWG的采样率设置为5MHz。

2、光束扫描
采用点扩散函数(PSF)优化的光束扫描方案,通过调整DEEPscope物镜的后孔径填充率来实现特定的数值孔径(NA)。具体而言,将后孔径以约85%填充(使用激发光束的半径),得到NA约为0.58,从而在整个视场(FOV)内实现轴向分辨率约为5μm(全宽半高,FWHM)以及横向分辨率约为0.7μm。

与轴向分辨率为2μm的PSF相比,在相同目标注量下,这种优化后的PSF能够使荧光信号提高约4倍,同时检测保真度指标(d’)提高约一倍。此外,还创建了一种双光束扫描方案,即两个具有5μm轴向分辨率的PSF在相邻两行进行扫描,时间延迟约为20ns。这种双光束扫描方案与轴向分辨率为10μm的PSF扫描相比,能够进一步提高d’值约10%(同时荧光信号提高约20%),并且在相同目标注量下,两者所需功率相同。而且,双光束扫描方案使有效激光重复率和线扫描速度翻倍,从而提高了空间和时间分辨率。

实验结果
1、大视场成像
DEEPscope在散射组织中成功实现了直径3.5mm的大视场单细胞分辨率成像。其实验装置利用2P和3P激发,3P激发路径包括自适应激发模块、光束生成延迟线和多边形扫描仪的扫描引擎,2P激发路径包括自适应激发模块、远程聚焦模块和与3P共用的多边形扫描引擎。

多边形扫描仪在该显微镜中发挥了关键作用,它实现了大扫描角度和高速扫描。与现有LFOV显微镜相比,它降低了扫描引擎的复杂性。同时,其光学路径和占地面积(约3ft×3ft×1ft)与传统多光子显微镜相近,但具有更大的孔径(9.5mm)和更宽的光学扫描角度(约42度峰-峰,在70%占空比下),其多边形线率(约6kHz)是相同光学扫描角度下5-mm孔径振镜扫描仪(<1kHz)的6倍以上。

2、提高多光子激发效率
自适应激发
优化的PSF和光束扫描方案显著提高了激发效率。对于优化的 d’,通过调整DEEPscope物镜的后孔径填充率,实现了数值孔径约为0.58的PSF,其尺寸接近神经元细胞体的最佳尺寸。与轴向分辨率为2μm的PSF相比,在相同目标注量下,该PSF使荧光信号提高约4倍,d’值提高约一倍。

光束扫描
进一步的双光束扫描方案,即两个具有5μm轴向分辨率的PSF进行扫描,与轴向分辨率为10μm的PSF扫描相比,进一步提高了d’值约10%(同时荧光信号提高约20%),并且使有效激光重复率和线扫描速度翻倍,从而提高了空间和时间分辨率。

在LFOV 2P和3P成像过程中,自适应激发方案通过在大血管阴影区域阻挡激光,有效地提高了感兴趣区域的有效功率。以皮质层6(L6)成像为例,在自适应激发时,荧光强度(以灰度级强度表示)增加。这是因为自适应激发时,感兴趣区域的有效功率从非自适应激发的130mW提高到224mW,而大脑表面的平均功率在自适应激发情况下低于非自适应激发情况。

3、单细胞分辨率的3P成像
结构成像
在转基因小鼠的皮质柱和海马CA1区域的锥体细胞层(SP)进行了3P LFOV结构成像。扫描区域为3.23mm×3.23mm,能够覆盖显微镜3.5mm直径FOV的大部分。在从100到1048μm 深度的堆栈成像中,观察到SP层表达GCaMP6s的神经元在约872μm深度出现,外部囊泡(EC)的髓鞘轴突产生的THG信号在视场中弯曲延伸,其范围从大脑表面下约600μm到 1048μm。

成像后,通过数字放大的图像和视频可以清晰看到整个皮质柱和皮层下区域标记的神经元。在血管标记的小鼠中,在大脑表面下800μm深度处测量得到轴向分辨率约为5μm,这为视场中某一特定位置的轴向分辨率提供了估计值。虽然未进行全面测量,但推测在深层组织成像时,轴向分辨率可能在整个LFOV内有所变化。

活动成像
记录了皮质L6中表达GCaMP6s的神经元的自发活动,展示了3P DEEPscope在深层皮质区域进行LFOV活动成像的能力。扫描区域为3.23mm×3.23mm,在600μm深度处(正好位于EC 上方)记录了大量神经元(917个)的活动轨迹。

扫描帧率为4Hz,这是由多边形扫描仪和两个光束实现的,使其扫描吞吐量与成像视场相匹配。然而,由于激光重复率的限制,有效帧率为2.6Hz(即每个像素每秒约被2.6个脉冲照射)。记录期间,平均每个神经元每秒约58个光子,对应d’约为2.3,低于常规3P成像在相同转基因小鼠中的d’值(约3)。

同时,还对海马SP神经元在930μm深度进行了成像,由于激光平均功率限制以防止组织加热,视场缩小为550μm×550μm,并记录了503个识别出的海马SP神经元中最活跃的42个神经元的荧光时间轨迹。

4、2P和3P双激发成像
不同深度的成像能力
设计的DEEPscope适用于910-930nm、1030-1050nm、1240-1380nm和1640-1750nm的激发波长,能够实现2P浅成像和3P深成像。对成年转基因小鼠脑表面下480μm的L5神经元进行成像,在不同视场和帧率下记录了大量神经元的活动轨迹,展示了2P成像的能力。

例如,在一种情况下,通过减少视场到3.23mm×1mm,实现了高空间分辨率活动成像(0.67μm像素尺寸),扫描帧率为 4Hz,此时可以清晰看到标记神经元的核排除和树突。在另一种情况下,记录了2000个神经元的活动轨迹,帧率为6Hz。

同时成像
同时进行了2P和3P活动成像,对成年转基因小鼠浅层和深层皮质表达GCaMP6s的神经元进行了六平面成像。在2P成像方面,以3.23mm×3.23mm FOV对五个焦平面在320、340、360、370、380、400μm深度进行成像,循环速率为2.2Hz;在3P 成像方面,在600μm深度进行成像,扫描帧率为11Hz。通过这种方式,能够在清醒条件下记录大量神经元(4523个)的活动轨迹。

5、成年斑马鱼脑的3P大视场成像
对成年斑马鱼脑进行了3P LFOV成像,从0到1090μm深度的堆栈中,在端脑、视顶盖和小脑区域可以清晰看到表达GCaMP6s的细胞核,THG信号显示了骨结构和纤维束,还能看到整个嗅球、嗅神经和部分嗅上皮。

结论与展望
DEEPscope为多光子显微镜在LFOV、深层和高分辨率成像方面提供了一种非常有前景的解决方案。其采用的多边形-振镜扫描仪大大降低了LFOV多光子成像系统的复杂性,使得成像系统更加简洁高效。

光束扫描和自适应激发方案具有模块化、可扩展的特点,能够很容易地集成到典型的多光子显微镜中,为现有显微镜的升级提供了可能。

DEEPscope不仅突破了传统多光子显微镜在视野和深度上的限制,还为大脑神经回路的系统研究提供了强而有力的工具。该设备所展示的技术可以轻松集成到现有的多光子显微镜中,使其能够广泛应用于神经科学及其他需要高分辨率深度组织成像的领域。该设备有望在神经科学领域的系统性疾病研究中,推动脑科学研究迈向新的高度,改变我们对大脑复杂网络及其在健康和疾病中的理解。

声明:本文仅用作学术目的。文章来源于:Mok, A.T., Wang, T., Zhao, S. et al. A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging. eLight 4, 20 (2024). https://doi.org/10.1186/s43593-024-00076-4

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