微型化多光子显微镜在自由活动动物成像中扮演着日益重要的角色，然而，其实践应用仍面临诸多挑战。多光子显微镜优异的光学切片能力导致其景深较浅（3至20µm，由轴向分辨率确定），成像视野通常在1mm²以内。在缺乏引导的情况下，要在跨越数毫米颅窗或梯度变折射率透镜（GRIN Lens）的三维空间中，快速定位目标感兴趣区域（ROI）仍具挑战性。尤其是对于缺乏经验的研究者而言，确认ROI并将微型化显微镜安装到小鼠头部可能耗费数十分钟甚至数小时，这极大限制了该技术在自由活动动物研究中的进一步应用。

为解决这一问题，开发团队在早期的工作中将宽场（WF）物镜与m2PM头戴式装置的微型化物镜（FHIRM-TPM）相结合，创建了用于定位的宽视场荧光成像装置。然而，由于早期的微型化物镜的视场有限（约150µm），在几毫米宽的颅窗内仍难以快速找寻感兴趣区域。此外，在切换至m2PM成像时，由于宽视场物镜的工作距离有限（约37.5mm），需要对光纤进行较大的弯曲，这使得操作更具挑战性。近期，Zong等人引入了旋转台来固定m2PM头戴装置，通过角度调整实现与某些特定的脑区更好的对准。尽管取得这些进展，但在三维脑组织中快速定位感兴趣区仍存在挑战，给新研究人员带来了陡峭的学习曲线。此外，当前m2/3PM的工作距离小于2mm，当使用z轴平台定位焦平面时，样本或物镜极易受损，对经验不足的用户尤为明显。总的来说，亟需开发一种具有增强引导功能的多模态成像平台，并建立标准化工作流程，以实现对自由活动动物的高效成像。

多模态荧光成像平台的系统设计
为解决这一问题，开发团队设计了多模态荧光成像平台，将宽场荧光导航系统（WF-Nav）与微型化双光子显微成像和微型化三光子显微成像进行了整合。为充分发挥单光子激发的优势，WF-Nav系统配备了大视场和单细胞分辨率功能，可快速识别指定感兴趣区域。一旦定位到目标区域，系统可无缝切换至双光子或三光子成像，进一步实现高信噪比或深层神经元成像。随后将m2PM或m3PM探头固定于小鼠头部，释放小鼠进行自由活动成像。

图1.多模态荧光成像系统设计

宽场荧光导航系统设计
WF-Nav系统由一台多色大视场宽场显微镜和多功能适配器组成。该系统采用三个LED作为激发光源（405nm，473nm，561nm），并配备高数值孔径的非球面聚光透镜对LED光束进行准直，每个激发光路均配有相应的滤光片组。为实现大视场导航并为无缝切换多光子镜组提供充足空间，开发团队设计了一款长工作距离、低倍率的干式物镜。该物镜（3.3x）采用反远摄设计：前组为两片胶合双合透镜提供负光焦度，后组由单片球面透镜构成。这种结构将主平面后移以校正色差，在保持数值孔径的同时实现了超长有效焦距的工作距离，最终达成90mm工作距离的突破性指标，并实现了Φ5.64mm的最大成像视场。

图2.宽场荧光显微镜设计

为实现宽场模式与多光子成像模式间的无缝切换，该团队设计了一款多功能适配器。该适配器连接宽场物镜，并在Z轴电动平台上进行焦距调节。通过标准化的m2/3PM探头设计，探头可稳固的安装在同一支架上，并保证了多光子与宽场模式切换时的齐焦成像。

图3.多功能适配器与齐焦功能

此款90mm工作距离的物镜为操作头件、光纤或加装可拆卸电动变焦透镜模块提供了充足空间。头件支架安装在滑动阻力极小（约0.1N）、伸缩距离12 mm的轻型直线滚珠滑轨上，可有效避免物镜与样本的碰撞风险。通过更换头件支架，系统可兼容不同头件，如mini2P和m3PM。此外，得益于微型化化双光子显微镜的尺寸与可回缩设计，相较于常规台式物镜，该系统在大多数方向上提供了更大的观察角度，从而带来了更广的样本观察范围。这一设计显著提升了样本的粗定位效率。

图4.不同物镜与微型化双光子显微镜观察角的对比

接下来，开发人员评估了宽场荧光显微镜的光学性能与实际应用。对Thy1-YFPH小鼠的脑切片进行成像，可以清晰识别出神经元和轴突。在470nm波长下进行活体钙离子成像，561nm波长下进行形态学成像，成功捕获了3804个GCaMP6f标记的神经元以及4650个表达mCherry的小鼠星形胶质细胞。这些结果证明了该宽场显微镜具备多色、单细胞分辨率和高通量成像能力，并提供了对感兴趣目标区域导航的出色性能。

图5.微型化宽场显微镜高通量成像

标准化微型多光子显微成像流程建立
为了让自由活动小鼠中的m2PM成像工作更加顺畅，开发人员建立了一套标准化成像流程，以提高自由活动动物中m2PM成像的效率。首先对动物进行病毒注射和外科手术操作，如颅窗植入或GRIN Lens植入，随后等待2-4周确保病毒充分表达及手术损伤恢复。以某次实验为例，我们在初级运动皮层（M1）神经元中标记了GCaMP6s和mCherry，随后将小鼠固定于WF-Nav装置下的跑步机上。接着通过宽场显微镜定位目标感兴趣区域并将其对准视野中心。随后通过适配器切换至m2PM模式，在920nm和1030nm波长下进行双色双光子成像，最后对XY轴和焦平面进行精细调整，可以在几分钟内确认最终的目标区域。大多数情况下，会将目标焦平面抬高约25µm，以补偿水泥收缩导致的焦点偏移，再将Baseplate固定在动物头部的头件上，经过约10分钟的固化后，小鼠即可进行自由活动成像。

图6.标准化自由活动微型双光子显微成像流程