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Roche利用SPR及单分子质量光度系统解码复杂抗体结合模式

2024-11-06     来源:本站     点击次数:318

TRIM21是一种已知的胞质Fc受体,在抗体介导的细胞内免疫中起着重要作用。之前的研究表明TRIM21与抗体的Fc区域结合,能够中和已经进入细胞的病毒,并通过泛素-蛋白酶体系统将其靶向降解,但是具体的工作机制还不是非常清楚。

Roche研发人员最近的工作发现了TRIM21识别、结合并促进抗体包被病毒的蛋白酶体降解的能力,在很大程度上依赖于其与抗体Fc区域相互作用的亲和力(Affinity)和功能亲合力(Aidity)。 经过一些列测试后研究人员提出了一种新的结合机制,TRIM21与一个Fc位点的结合导致PRYSPRY从螺旋卷曲域上脱落,由于其柔性连接链增加了流动性,从而促进了Fc第二个位点的结合,这种双价结合产生了功能亲合力(Aidity)。

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为了研究TRIM21与IgG的结合动态,研究人员首先采用两种重组TRIM21构建体,同时构建了包含PRYSPRY和卷曲螺旋结构域的TRIM21-CC-PS的结构,来模拟TRIM21的天然二聚体状态。然后通过SPR的方法测试TRIM21与一系列human IgG1 (mAb1)突变体的亲和力。

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Interaction analysis of human IgG1 (mAb1) Fc variants and TRIM21 PRYSPRY domain

 
实验结果展示了抗体Fc端具有双价态结合功能可以与两个TRIM21结合,利用单分子质量光度系统不但可以确认SPR的测试结果,而且由于TRIM21天然形成同源二聚体具有比传统1:1相互作用更为复杂的结合模式,质量光度系统具有更大的优势来测定结合化学计量比。

大多数抗体构建体对PRYSPRY的亲和力是相似的,但是结合界面的关键残基上含有Fc突变的变体YTE(M252Y, S254T, T256E)、HH(T307H, N434H)和Y436A,对PRYSPRY结构域的亲和力比野生型(WT)更低一些,结合强度顺序如下:WT具有最强的亲和力,其次是YTE,然后是HH,Y436A的亲和力最弱。研究人员还发现Y436A与野生型相比亲和力降低了180倍,SPR和单分子质量光度系统(MP)结果揭示了PRYSPRY-IgG的化学计量比为2:1,且没有表现出任何结合协同性,没有显示Fab结合的额外贡献。

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Mass distribution of Fc WT / cytokine-Fc Fusion WT / cytokine-Fc Fusion WT-AAA

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Mass distribution of cytokine-Fc Fusion WT / WT-AAA / Y436A

研究人员随后进一步确定了TRIM21-CC-PS二聚体的状态,二聚体结构的预期理论分子量是86千道尔顿。体积排阻色谱-多角光散射(SEC-MALS)显示,94%的颗粒质量约为90千道尔顿。质量光度测量(MP)显示99%的颗粒重量为82 ± 13千道尔顿。电子显微镜分析揭示,PRYSPRY结构域彼此相对,卷曲螺旋结构域在中间介导其二聚体化。

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Dimer of TRIM21-CC-PS determined by MP and EM

为了深入研究TRIM21-CC-PS与抗体Fc的结合模式,研究人员进一步采用了单分子质量光度系统和EM两种技术。在MP测量中,将不同浓度递增的TRIM21-CC-PS与三种抗体Fc变体(mAb1 WT、mAb1 WT-AAA和mAb1 AAA)分别以不同的摩尔比例孵化。将TRIM21-CC-PS与mAb1混合后,出现了大约80 kDa和140 kDa的峰,分别代表未结合的TRIM21-CC-PS和mAb1。在大约230 kDa处出现了第三个峰,其分子量对应于由一个TRIM21-CC-PS和一个mAb1 WT组成的复合物。随着TRIM21-CC-PS浓度的增加,平衡向结合物种转移直到几乎所有的抗体都被结合。在TRIM21-CC-PS的10倍摩尔过量下,24%的TRIM21-CC-PS和mAb1 WT结合,揭示了1:1的化学计量比,其中一个二聚体同时与两个IgG重链结合。在低纳摩尔浓度下检测TRIM21-CC-PS与mAb1 WT的相互作用,也使研究人员洞察到了二聚体结合导致的强烈相互作用,进而实现功能亲合力(Avidity)结合模式。
 
另外,mAb1 WT-AAA浓度显示了很小一部分结合分数(约2%),而AAA变体则没有形成复合物。有意思的是研究人员预期mAb1 WT-AAA变体会有结合,但是实验中只观察到两个Fc重链中的一个结合导致了亲和力变弱,而对称的AAA突变完全取消了TRIM21的结合。值得注意的是,数据表明TRIM21可以通过与一个结合位点与A20抗体的两个不同Fc区域的同时相互作用,从而最终诱导AAV颗粒聚集。

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Investigate the TRIM21-CC-PS - Antibody Fc binding mode by MP

在低纳摩尔浓度下检测到TRIM21-CC-PS与mAb1野生型之间的相互作用,正如在AlphaFold模型(Uniprot ID P19474)中所观察到的,PRYSPRY结构域通过一个柔性连接链附着在其螺旋上。这个连接链可能通过将PRYSPRY结构域彼此拉近,允许二聚体结合。

最后,研究人员探索了TRIM21与重组腺相关病毒载体(rAAVv)颗粒之间的相互作用,发现通过TRIM21的参与来介导目标结合(AAV)和效应功能实现功能亲合力,展示了这些相互作用的多面性。

综上所述Roche科研人员的这些发现揭示了TRIM21在抗病毒免疫中的双重作用,既识别、引导病毒进行细胞内降解,也展示了其在细胞内中和的病毒感染治疗中上的潜力。该研究推进了对细胞内免疫反应的理解,并为利用TRIM21独特结合模式开发抗病毒策略和创新设计开辟了新途径。
 
Reference:
Reusch J, et al. TRIM21 and Fc-engineered antibodies: decoding its complex antibody binding mode with implications for viral neutralization. Front Immunol. 2024 Jun 12;15:1401471.
 

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