期刊：Frontiers in Immunology
影响因子：5.7
伯豪合作技术：单细胞转录组、TCR免疫组库

导语
播散性结核病（DTB）是一种严重的结核病形式，由结核分枝杆菌通过血液循环传播至肺外部位和中枢神经系统，常表现为发热、盗汗、疲劳等症状，且多见于免疫受损人群。由于缺乏准确的生物标志物，DTB的早期诊断较为困难。作者通过对7名DTB患者的外周血单个核细胞进行单细胞RNA测序，并整合分析了来自潜伏性结核感染、活动性结核患者和健康对照的数据，发现DTB患者外周血中炎症免疫细胞（如单核细胞和巨噬细胞）的比例显著增加，而T细胞、B细胞和浆细胞等淋巴细胞的丰度显著降低，提示淋巴细胞减少是DTB的一个显著特征。此外，T细胞功能耗竭和黏膜相关不变T细胞（MAIT细胞）的缺失也在DTB患者中表现突出，且TCR库分析显示了特定的基因段和克隆型特征。这些发现不仅揭示了DTB的免疫学特征，还为开发新的诊断标志物和治疗策略提供了重要的科学依据。

主要技术
单细胞转录组、TCR免疫组库
（技术服务由伯豪生物合作完成）

研究结果
1. DTB患者外周血单细胞转录谱
为了深入剖析播散性结核病（DTB）发展过程中的单细胞转录组特征，作者从7名DTB患者中采集了外周血样本，并利用10x Genomics平台开展了单细胞RNA测序（scRNA-seq），具体实验设计如图1A所示。通过分析特定标记基因的表达，作者将细胞群体划分为九种主要细胞类型和十五种细胞亚群。UMAP图清晰地呈现了健康对照组、活动性结核（TB）、潜伏性结核感染（LTBI）以及DTB患者之间细胞类型的独特分布特征。鉴定出的细胞类型包括B细胞、T细胞、上皮细胞、天然淋巴细胞（ILCs）、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）和浆细胞（图1B和1C）。随后，作者详细分析了细胞群体的比例以及排名前十的上调基因的表达水平（图1D）。与健康对照组（HC）、LTBI和活动性结核（PTB）患者相比，DTB患者中先天免疫相关的巨噬细胞和单核细胞的基因表达显著增加，而T细胞、B细胞和浆细胞的水平则明显下降。

图1 研究设计与外周血单个核细胞（PBMCs）单细胞转录组分析的整体结果

2. 基因表达和伪时间分析揭示了DTB中T细胞的分化特征
与健康对照组和其他结核病样本相比，DTB样本在UMAP图中显示的T细胞亚群分布存在显著差异，这表明DTB患者的T细胞基因表达谱发生了独特的变化（图2A）。作者进一步分析了T细胞中表达量最高的十个基因（图1D），例如CAMK4、TRAC和INPP4B，发现这些基因在DTB样本中的表达水平显著降低（图2E）。为了量化各细胞亚群与疾病的相关性，作者采用了观察值与预期值的细胞比例（R o/e）进行分析。结果显示，巨噬细胞和单核细胞的R o/e比例倾向于与DTB相关，而细胞毒性T细胞和记忆B细胞则表现出相反的趋势（图2B、C）。鉴于DTB患者T细胞独特的基因表达谱，作者进一步进行了伪时间分析，将从初始T细胞到细胞毒性T细胞的分化过程定义为时间顺序。许多基因在伪时间分析中表现出高度的变异性，其中大多数基因的表达量随着伪时间的推移在DTB患者中逐渐降低（图2D、图2F）。这一结果表明，随着细胞分化的进行，基因表达水平显著下降，这暗示了T细胞可能发生了功能耗竭。

图2 DTB中T细胞亚群的特异性基因表达谱

3. DTB中的T细胞耗竭及MAIT细胞显著缺失
作者对T细胞进行分类（图3A），包括CD4-CD8-，CD4+CD8+，CD4+和CD8+，发现CD4+和CD8+ T细胞在所有样本中占主导地位，且DTB患者的T细胞表现出显著不同的基因表达谱（图3B-G）。与PTB和LTBI相比，DTB患者的耗竭基因表达显著更高，尤其在CD8+ T细胞中。此外，CD8+ T细胞在DTB患者中高表达多种效应分子，如PRF1、GNLY和GZMB，而MAIT细胞在DTB样本中几乎完全缺失（图3I、3J），暗示DTB患者存在显著的免疫功能缺陷。

图3 DTB中的T细胞耗竭与MAIT细胞严重缺失

4. TCR-V（D）J基因重排
MAIT细胞的发育依赖于TCR重排和与MR1分子的相互作用。作者对多种T细胞亚型（包括CD4+初始T细胞、CD4+中央记忆T细胞、CD8+ T细胞和γδ T细胞）进行了UMAP分析（图4A和4B），并研究了TCR克隆型比例和V、J基因的使用频率。结果显示，TRA中TRAV9-2、TRAV13-1和TRAV29DV5是主要的V基因，TRAJ49是主要的J基因；TRB中TRBV20-1是主要的V基因，TRBJ2-7和TRBJ2-1是主要的J基因（图4E）。CDR3序列长度主要集中在10到15个氨基酸之间，样本间存在差异。进一步分析发现，CDR3中“CASSL”片段最常见，且不同样本中相同片段的比例相对一致。在TRA中，TRAV1-2-TRAJ33和TRAV13-2TRAJ42共存，其中TRAV1-2-TRAJ33最为常见；在TRB中，TRBV5-1 TRBJ2-3和TRBV9 TRBJ1-1较为常见。MAIT细胞表达半不变的TCR α链TRAV1-2-TRAJ33，其在DTB样本中的频率低于健康对照组（图5D），提示其与MAIT细胞功能的关系值得进一步研究。
 

图4  T细胞受体V(D)J基因重排

总结
本研究首次从单细胞水平分析了播散性结核病（DTB）患者的外周血细胞亚群，揭示了其独特的TCR特征。尽管样本量受限且存在年龄差异，但通过先进算法和与其他单细胞数据的对比验证，研究结果的可靠性和相关性得到了增强。尽管年龄差异可能对免疫特征有一定影响，但整体上并未显著干扰研究结论。本研究为深入理解DTB的免疫细胞特征提供了重要资源，并为开发新的治疗策略和特异性疫苗奠定了基础。

参考文献：
Gong Z, Xu H, Zhang Q, Wang G, Fan L, Wang Z, Fan L, Liu C, Yu Y, Liu Z, Zhou Q, Xiao H, Hou R, Zhao Y, Chen Y and Xie J (2025) Unveiling the immunological landscape of disseminated tuberculosis: a single-cell transcriptome perspective. Front. Immunol. 16:1527592. doi: 10.3389/fimmu.2025.1527592.