大脑结构的尺度跨越极大，从纳米级的突触到厘米级的整个大脑，要想全面解析大脑的连接奥秘，就需要一种能够跨越多个空间尺度的成像技术。日本联合研究团队在《iScience》发表了突破性成果，研究人员开发出一种结合组织透明化方法（ScaleSF）与连续光镜/电镜（LM/EM）成像的多尺度神经元成像技术首次实现了从全脑宏观观察到突触纳米结构解析的无缝衔接，为揭示神经环路的跨尺度组织规律提供了革命性工具。

研究背景与技术挑战
在神经连接组学研究领域，光镜与电镜技术长期处于割裂状态。荧光标记技术结合组织透明化方法（如CUBIC、CLARITY）虽能实现全脑尺度的神经元追踪，但受光学衍射极限制约，无法确认直径仅300纳米的突触连接。而基于连续切片电镜的技术虽能重建突触级连接，却因成像通量限制仅能分析毫米级组织块。这种技术鸿沟导致研究者无法在同一样本中同时获取神经环路的拓扑结构与突触连接特性。更严峻的是，传统透明化方法使用的强去垢剂会破坏细胞超微结构，而电镜兼容的固定剂戊二醛又会淬灭荧光信号，使得多尺度成像的技术整合举步维艰。

技术创新与应用
研究团队通过三重技术突破构建了多尺度成像体系。首先开发的ScaleSF透明化方法，在保持样本尺寸稳定的前提下，将1mm厚脑片的透光率提升至90%以上，其次设计的双模态探针，通过酪胺信号放大系统在透明化处理后仍保持强电镜对比度，轴向标记分辨率达250nm。最后构建的高效表达系统使探针在神经元胞体与轴突末梢的标记强度提升4.7倍，支持从全脑追踪到单突触解析的连续观测。

该技术体系成功应用于三个典型神经环路研究。在小鼠纹状体-苍白球通路中，研究人员首次通过连续成像证实了纹状体投射神经元的无髓鞘特性；狨猴皮层-纹状体环路的全脑成像则揭示了灵长类特有的突触分布规律；最引人注目的是小鼠胼胝体环路研究，证明了该技术在稀疏连接解析中的独特优势。

成像实验与结果分析
成像实验设计
在验证多尺度成像技术可行性的实验中，研究人员精心设计了一系列实验方案。他们选择了小鼠纹状体传出系统、小鼠胼胝体系统以及狨猴皮质纹状体投射系统作为研究对象。这些系统在大脑功能中具有重要作用，且其神经连接的复杂性和多样性能够充分检验成像技术的性能。

为了实现对不同尺度结构的精准追踪，研究人员采用了多种标记方法。利用GFP和RFP荧光、DAB-Ni²标记以及大脑结构形状、血管和细胞核等内源性标志物，确保在不同成像尺度下都能准确识别和追踪目标结构。同时实现了光镜和电镜数据集的明确关联。

小鼠纹状体传出系统成像结果
以小鼠纹状体传出系统为模型，研究人员展示了多尺度成像技术的强大功能。在实验中，他们将携带载体注射到小鼠的尾状核-壳核（CPu）。四周后，对大脑进行固定、透明化处理，并利用共聚焦激光扫描显微镜进行宏观和中尺度神经回路映射。结果清晰地观察到EGFP标记的纤维从CPu延伸到脑干，在苍白球外侧部（GPe）和黑质（SN）形成密集的终末场。

进一步对感兴趣的神经元进行重新切片和高分辨率成像，详细记录了标记神经元的形态。在GPe神经元的树突上，研究人员确认了对称突触的存在，其特征为缺乏突触后致密物（PSD）和狭窄的突触间隙。这一结果不仅验证了成像技术在解析神经回路和突触连接方面的准确性，还为深入研究纹状体传出系统的功能提供了重要的结构基础。

小鼠胼胝体系统成像结果
小鼠胼胝体系统的成像实验聚焦于胼胝体对新皮质中间神经元的突触输入。在对透明化脑切片进行共聚焦激光扫描显微镜成像时，研究人员观察到EGFP标记的轴突从小鼠初级运动皮层穿过胼胝体，投射到对侧皮层，与标记的PV中间神经元相互作用。通过仔细筛选大量的连续图像，他们发现了胼胝体轴突终末与PV新皮质中间神经元树突之间的一个接触点。经过重新切片、复染和成像，证实了这个接触点确实形成了突触连接，且为不对称突触，具有典型的PSD结构。这一结果展示了多尺度成像技术在捕捉稀缺突触接触方面的卓越能力，为研究大脑半球间的信息传递提供了新的视角。

狨猴皮质纹状体投射系统成像结果
为了验证多尺度成像技术在大型哺乳动物大脑研究中的有效性，研究人员以狨猴为模型，对其皮质纹状体投射系统进行成像。宏观全脑成像显示，APEX2表达标记出了神经元聚集区域。对透明化的脑切片进行成像，清晰地观察到EGFP标记的轴突从初级躯体感觉皮层（S1）延伸到皮层下，并在壳核形成密集的终末场。重新切片后进行微观亚细胞成像，详细记录了标记神经元的形态，包括锥体神经元的胞体、树突和轴突投射。最后，通过成像在纳米尺度下观察到了突触结构，如不对称突触。这些结果表明，多尺度成像技术能够在狨猴大脑中实现从宏观到微观的有效成像，为研究灵长类动物大脑的神经连接提供了有力工具。

总结与展望
ScaleSF技术体系的建立标志着神经成像技术进入多尺度融合的新纪元。其核心突破在于打破了组织透明化与超微结构保存的互斥困境，这种技术整合使研究者首次能在同一标本中完成脑区连接图谱绘制与突触类型鉴定，为解析神经环路的空间编码机制提供了关键工具。在转化应用层面，该技术特别适用于退行性疾病研究，例如在帕金森病模型中同步追踪黑质多巴胺能神经元的大尺度退变过程与突触超微结构改变。未来，技术优化将聚焦三个方向：开发全脑透明化方案以获取完整投射信息，目前1mm切片导致长程连接追踪完整度仅68%；建立多色标记体系，通过APEX2变体实现不同神经元类型的突触特异性标记；结合AI图像分析，构建从全脑到突触的自动化重建流程。随着相关技术的持续突破，有望在五年内实现厘米级哺乳动物脑的完整连接组解析，最终揭开意识与认知的物质基础之谜。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Furuta T, Yamauchi K, Okamoto S, Takahashi M, Kakuta S, Ishida Y, Takenaka A, Yoshida A, Uchiyama Y, Koike M, Isa K, Isa T, Hioki H. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 2021 Dec 27;25(1):103601.

DOI:10.1016/j.isci.2021.103601.