文献解读：超声波破解镇痛密码探究阿片类止痛药如何“改造”大脑
2025-04-17 来源:本站 点击次数:317
功能性超声（functional ultrasound, fUS）技术是一种新型的脑功能成像技术，其最关键的革新在于能够方便地实现清醒活动动物的脑功能成像，突破了传统技术的局限，为各种行为范式下的全脑功能检测提供了新的可能性。此外，该技术具有更高的信噪比与时空分辨率，这些优点使得基于fUS的药理学检测成为一种强大的研究手段。
我们往期的公众号已经介绍了fUS药理学的很多相关内容：
◾ fUS脑功能成像技术在药物研究中的应用（点击链接，查看内容）
◾ 在清醒动物上用fUS技术开展药理学实验（点击链接，查看内容）
这次我们继续介绍一篇采用fUS技术来研究神经药理的文章，文章标题是“Opioid-Induced Inter-regional Dysconnectivity Correlates with Analgesia in Awake Mouse Brains”，来自法国国家健康与医学研究院（INSERM）的Zsolt Lenkei教授和Andrea Kliewer教授团队。
在这篇文章中作者提出的“功能连接指纹”这一概念，从这个角度可以更好地解读fUS所提供的庞杂信息，相信能够给未来药理学的全脑功能研究提供新的启迪。
研究背景
由于对药物如何影响大脑功能的理解不足，难以开发高效且低副作用的镇痛药和抗精神病药。传统功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）虽能通过血氧信号间接反映脑活动与功能连接（functional connectivity, FC），但需麻醉动物，而麻醉剂（如美托咪定）会干扰皮质-丘脑连接，影响镇痛研究。
为此，研究者引入fUS技术，其具备亚秒级时间分辨率和100微米空间分辨率，可在清醒小鼠中无创监测脑血流（cerebral blood volume, CBV）和FC。研究以μ-阿片受体（mu-opioid receptor, MOP）激动剂（吗啡、芬太尼等）为模型，通过单冠状脑片高灵敏度成像，发现阿片类药物能够显著引发新皮层-海马-丘脑网络功能连接重组（剂量与时间依赖性），且这种“功能连接指纹”与镇痛效果及MOP激活同步，但与呼吸抑制等副作用无关。慢性用药后，功能连接变化与镇痛耐受一致。研究结合行为学（运动、镇痛）和分子指标（MOP磷酸化），验证了功能连接作为药效标志物的可靠性，为开发精准神经精神药物提供了新策略。
研究结果
清醒小鼠中吗啡的药理fUS特征
为了研究阿片类药物对大脑功能的影响，作者利用fUS在清醒未处理颅骨小鼠上进行脑功能成像，这一工作在ICONEUS fUS成像系统和气浮笼上完成，后者为头部固定的小鼠提供易于适应的活动空间和稳定的成像效果，最大程度地保证清醒小鼠fUS的实验效果。
在给药前，记录20分钟作为基线，注射药物后记录60分钟观察药物作用，基线和给药后的时间都以10分钟来划分区段，BP1-2为两个给药前时间段，SP1-6是给药后的6个时间段。对记录到的信号进行经典的功能连接分析，这一方法在fMRI中被广泛采用，检测的是脑区之间自发波动的相关性强弱，这一指标和大脑的功能状态密切相关，在药理学研究中，给药前后的功能连接变化可以反应药物对大脑功能状态的改变。
图1. 清醒动物中的药理fUS方法和吗啡的检测结果。(I) ROI功能连接相关性/显著性矩阵。方框标注四个元区域（皮层、海马、丘脑和下丘脑）。左下三角显示（蓝色-红色）给药后平均相关性矩阵，右上三角展示（绿色-紫色）显著性差异的ROI对的功能连接改变量。(J) 显著性相关图展示矩阵中显著变化部分：节点编码各ROI的全局连接性，绿色-紫色边表示相关性显著变化的边。
图1. 清醒动物中的药理fUS方法和吗啡的检测结果。(K) 几个特征性脑区的seedmap分析图。上行（蓝色-红色）代表给药后各脑区平均的seedmap功能连接，下行（绿色-紫色）代表seedmap上有显著性差异的位置的功能连接变化量。
功能连接的分析通常有两种不同的方式，一种为matrix分析（图1. I J），一种为seed map分析（图1. K），前者反应成像范围中所有目标脑区两两间的相关性，后者反应一个特定脑区与图像中其它部分之间的相关性强弱。
接下来，作者首先对代表性的阿片类止痛药物吗啡做了药理fUS检测。在图1中我们可以清楚地看到，在注射后40分钟，皮层-皮层区域和海马-丘脑之间的功能连接增强，而皮层与皮下结构之间的功能连接则减少（图1. I J K）。
这些结果表明，在清醒小鼠大脑中，吗啡显著重塑了区域内和区域间的功能连接模式，其主要特征为皮层与皮下结构之间出现负相关。
多种阿片类药物的功能连接指纹特征
在这里作者提到了一个重要的概念：功能连接指纹特征（FC fingerprints），有助于我们更好地理解药理fUS的结果。从吗啡的检测结果可以看到，fUS提供的是大范围多脑区的功能连接检测结果，其中包含的信息量巨大，我应该如何解读这样的结果？在这里，作者将药物引起的大量脑区的功能连接改变作为一个整体来考察，不同药物的作用可以看作一个独特的功能连接指纹，不同指纹在模式上的异同可以反应药物效应的差异性和近似性。
因此，作者检测了多种不同的阿片类药物，包括芬太尼、甲苯咪唑和丁丙诺啡，得到了不同药物的功能连接指纹。
这些结果显示，主要的阿片类药物会引发一种高度一致的功能失连模式，作者称之为“阿片指纹”（opioid fingerprint），药物耐受的实验更强有力地支持了阿片类药物诱导的、MOP特异性的功能连接指纹在功能上的重要性，也进一步突显其在响应不同MOP作用配体中的意义。
功能连接指纹与脑血容量、行为和MOP激活水平的相关性
除了前文提到用fUS来检测给药前后功能连接的改变，药理学fUS另一个常用的方式是直接检测药物引起的各脑区灌注（CBV）的改变。清醒小鼠上的检测发现，注射吗啡或芬太尼（但非生理盐水）后的CBV变化表现为典型的先期区域性高灌注，随后是较长时间的低灌注，其振幅和动态与剂量和MOP激动剂效能密切相关（图5. A）。
为验证这些观察结果，作者对70 mg/kg 吗啡实验中除呼吸抑制外的所有生理指标进行了PCA分析（图6C-E）。结果显示，仅两个主成分即可解释大部分变量变化：第一个主成分（PC1）与FC指数、镇痛和MOP磷酸化高度相关；第二个主成分（PC2）与运动和CBV最相关（图5D）。这些实验结果表明：阿片类药物引起的FC变化具有重要药理学意义，因为它们是MOP特异性的，体现了时间依赖性、剂量依赖性以及耐受性的发展。更重要的是，与局部灌注变化不同，FC的改变与镇痛效应这一临床重要行为输出高度相关，而与呼吸抑制这一严重副作用无明显相关。
总结
这篇工作给我们提供了一个非常好的实例，如何利用fUS来进行神经药理学的研究：
1. fUS非常适合在清醒活动的动物上进行大范围的脑功能检测，并且具有极佳的敏感性和时空分辨率，并且可以透过颅骨成像，非侵入性地进行成像，是小动物药理学研究中一个非常重要的新工具。
2. 功能连接指纹：由于fUS能供提供大量脑区的巨量信息，因此我们可以从“功能指纹”的角度理解这些信息。在这篇文章中，作者发现多种阿片类药物引起的功能连接改变具有高度的一致性，这种共有的变化模式被作者称为“阿片指纹”，进一步的研究表明这种阿片指纹由MOP介导，并与镇痛效果高度相关。因此这种“指纹”可以作为一种关键性的biomarker，用于镇痛药物的开发与评估。
3. 药理学fUS可以提供两种不同的检测方式：
a) 功能连接，即检测给药前后不同时间段的多脑区功能连接改变
b) 局部脑灌注，即给药前后各脑区CBV的改变
在这篇工作中，通过与分子学，行为学的相关检测数据的相关性分析发现，FC改变与镇痛效果高度相关，而与活动的增多无关；而CBV的快速改变则与给药后动物活动的增加有高相关性，但也有部分CBV的改变并非由动物的活动增加引起，提示可能与神经活动的增加有关。
参考文献
英文原文链接：https://doi.org/10.1101/2024.07.30.604249
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◾ fUS脑功能成像技术在药物研究中的应用（点击链接，查看内容）
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这次我们继续介绍一篇采用fUS技术来研究神经药理的文章，文章标题是“Opioid-Induced Inter-regional Dysconnectivity Correlates with Analgesia in Awake Mouse Brains”，来自法国国家健康与医学研究院（INSERM）的Zsolt Lenkei教授和Andrea Kliewer教授团队。
研究背景
由于对药物如何影响大脑功能的理解不足，难以开发高效且低副作用的镇痛药和抗精神病药。传统功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）虽能通过血氧信号间接反映脑活动与功能连接（functional connectivity, FC），但需麻醉动物，而麻醉剂（如美托咪定）会干扰皮质-丘脑连接，影响镇痛研究。
为此，研究者引入fUS技术，其具备亚秒级时间分辨率和100微米空间分辨率，可在清醒小鼠中无创监测脑血流（cerebral blood volume, CBV）和FC。研究以μ-阿片受体（mu-opioid receptor, MOP）激动剂（吗啡、芬太尼等）为模型，通过单冠状脑片高灵敏度成像，发现阿片类药物能够显著引发新皮层-海马-丘脑网络功能连接重组（剂量与时间依赖性），且这种“功能连接指纹”与镇痛效果及MOP激活同步，但与呼吸抑制等副作用无关。慢性用药后，功能连接变化与镇痛耐受一致。研究结合行为学（运动、镇痛）和分子指标（MOP磷酸化），验证了功能连接作为药效标志物的可靠性，为开发精准神经精神药物提供了新策略。
研究结果
清醒小鼠中吗啡的药理fUS特征
为了研究阿片类药物对大脑功能的影响，作者利用fUS在清醒未处理颅骨小鼠上进行脑功能成像，这一工作在ICONEUS fUS成像系统和气浮笼上完成，后者为头部固定的小鼠提供易于适应的活动空间和稳定的成像效果，最大程度地保证清醒小鼠fUS的实验效果。
在给药前，记录20分钟作为基线，注射药物后记录60分钟观察药物作用，基线和给药后的时间都以10分钟来划分区段，BP1-2为两个给药前时间段，SP1-6是给药后的6个时间段。对记录到的信号进行经典的功能连接分析，这一方法在fMRI中被广泛采用，检测的是脑区之间自发波动的相关性强弱，这一指标和大脑的功能状态密切相关，在药理学研究中，给药前后的功能连接变化可以反应药物对大脑功能状态的改变。
图1. 清醒动物中的药理fUS方法和吗啡的检测结果。(A-C)
图1. 清醒动物中的药理fUS方法和吗啡的检测结果。(D-H)
功能连接的分析通常有两种不同的方式，一种为matrix分析（图1. I J），一种为seed map分析（图1. K），前者反应成像范围中所有目标脑区两两间的相关性，后者反应一个特定脑区与图像中其它部分之间的相关性强弱。
接下来，作者首先对代表性的阿片类止痛药物吗啡做了药理fUS检测。在图1中我们可以清楚地看到，在注射后40分钟，皮层-皮层区域和海马-丘脑之间的功能连接增强，而皮层与皮下结构之间的功能连接则减少（图1. I J K）。
图2. 吗啡功能连接（FC）特征的剂量与时间依赖性。
随后，作者进一步检测了不同剂量和不同时间点吗啡引起的功能连接改变。图2中我们可以看到，注射生理盐水对各时间点（给药前BP1-2，给药后SP1-6）的功能连接没有影响。相比之下，随着吗啡剂量的增加，功能连接变化出现得更早，可能反映出更早达到MOP占据的关键水平，而较高剂量导致更强的FC变化。这些结果表明，在清醒小鼠大脑中，吗啡显著重塑了区域内和区域间的功能连接模式，其主要特征为皮层与皮下结构之间出现负相关。
多种阿片类药物的功能连接指纹特征
在这里作者提到了一个重要的概念：功能连接指纹特征（FC fingerprints），有助于我们更好地理解药理fUS的结果。从吗啡的检测结果可以看到，fUS提供的是大范围多脑区的功能连接检测结果，其中包含的信息量巨大，我应该如何解读这样的结果？在这里，作者将药物引起的大量脑区的功能连接改变作为一个整体来考察，不同药物的作用可以看作一个独特的功能连接指纹，不同指纹在模式上的异同可以反应药物效应的差异性和近似性。
因此，作者检测了多种不同的阿片类药物，包括芬太尼、甲苯咪唑和丁丙诺啡，得到了不同药物的功能连接指纹。
图3. 不同阿片类药物对功能连接影响的特征
图3结果显示，类似于吗啡，芬太尼剂量升高引发的功能连接变化更早更显著，呈现出与吗啡相似的脑区间功能失连模式。甲苯咪唑（完全激动剂）也表现出类似模式，而丁丙诺啡（部分激动剂）虽有类似模式但强度较弱，这一结果整体表明功能连接模式的变化强度与MOP激动剂的效能密切相关。 图4. 阿片类受体耐受情况中的功能连接指纹特征
阿片类药物的行为效应（如镇痛、欣快和镇静）在重复给药后会产生耐受性。因此，患者或药物使用者需要更高剂量才能获得相同效果，这也带来了呼吸抑制、便秘、成瘾和过量等副作用风险的增加。作者希望研究吗啡和芬太尼诱导的FC变化是否也表现出耐受性特征。为此，作者使用植入的渗透泵对小鼠进行为期一周的慢性吗啡或芬太尼给药处理，结果显示镇痛效应已显著减弱。值得注意的是，该方案在单次注射后所引起的功能连接显著变化也减少了，表明与未慢性处理动物相比，其响应减弱（图4）。这些结果显示，主要的阿片类药物会引发一种高度一致的功能失连模式，作者称之为“阿片指纹”（opioid fingerprint），药物耐受的实验更强有力地支持了阿片类药物诱导的、MOP特异性的功能连接指纹在功能上的重要性，也进一步突显其在响应不同MOP作用配体中的意义。
功能连接指纹与脑血容量、行为和MOP激活水平的相关性
除了前文提到用fUS来检测给药前后功能连接的改变，药理学fUS另一个常用的方式是直接检测药物引起的各脑区灌注（CBV）的改变。清醒小鼠上的检测发现，注射吗啡或芬太尼（但非生理盐水）后的CBV变化表现为典型的先期区域性高灌注，随后是较长时间的低灌注，其振幅和动态与剂量和MOP激动剂效能密切相关（图5. A）。
图5. 吗啡诱导的功能连接（FC）变化与灌注、MOP激活和行为的相关性。
接下来，作者希望进一步理解之前发现的MOP特异性FC变化与脑灌注改变及阿片类药物诱导的行为之间的关系。分析结果显示，各脑区CBV的改变与动物注射阿片类药物短时间内活动的增加相关，但也并非完全由活动增加引起，而药物引起的呼吸抑制（阿片类药物重要的临床副作用）也与CBV变化在时间上相关。值得强调的是，这些血管和行为事件在时间上与FC变化的相关性较低，虽然运动、呼吸和CBV的变化快速且同步，但吗啡诱导的功能连接重组相对较慢（图5. A B）。为验证这些观察结果，作者对70 mg/kg 吗啡实验中除呼吸抑制外的所有生理指标进行了PCA分析（图6C-E）。结果显示，仅两个主成分即可解释大部分变量变化：第一个主成分（PC1）与FC指数、镇痛和MOP磷酸化高度相关；第二个主成分（PC2）与运动和CBV最相关（图5D）。这些实验结果表明：阿片类药物引起的FC变化具有重要药理学意义，因为它们是MOP特异性的，体现了时间依赖性、剂量依赖性以及耐受性的发展。更重要的是，与局部灌注变化不同，FC的改变与镇痛效应这一临床重要行为输出高度相关，而与呼吸抑制这一严重副作用无明显相关。
总结
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3. 药理学fUS可以提供两种不同的检测方式：
a) 功能连接，即检测给药前后不同时间段的多脑区功能连接改变
b) 局部脑灌注，即给药前后各脑区CBV的改变
在这篇工作中，通过与分子学，行为学的相关检测数据的相关性分析发现，FC改变与镇痛效果高度相关，而与活动的增多无关；而CBV的快速改变则与给药后动物活动的增加有高相关性，但也有部分CBV的改变并非由动物的活动增加引起，提示可能与神经活动的增加有关。
参考文献
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