生物力学研究在揭示细胞功能调控、组织发育和疾病机制中具有不可替代的作用。传统力学检测技术依赖物理接触或外力加载，难以实现非侵入式三维动态观测。布里渊显微镜（Brillouin microscopy，BM）的出现带来了新的希望。近期，发表于《Nature Methods》的一项研究成果，更是为布里渊显微镜技术带来了重大突破，首次实现了对斑马鱼幼体、线虫胚胎等光敏感生物样本的高分辨率长时间观测，为活体生物力学研究开辟了新路径。

研究背景与技术挑战
生物力学研究的关键意义
过去几十年，生物力学领域致力于解开机械力、材料特性和生化信号之间的复杂关系。这些因素紧密协作，共同调控着细胞的功能和组织的有序构建。例如，细胞所处微环境的力学性质会显著影响细胞的增殖、分化和迁移等关键行为。在肿瘤的发展过程中，癌细胞所处微环境的力学变化会促使癌细胞更具侵袭性，导致肿瘤的扩散。然而，现有的生物物理技术大多依赖直接物理接触，需要对样本施加外力来进行测量。这种方式存在明显的局限性，一方面只能获取样本表面的信息，另一方面缺乏在三维空间中对细胞进行高分辨率观测的能力，无法满足对生物样本微观力学特性深入研究的需求。

布里渊显微镜技术崭露头角
布里渊显微镜作为一种新兴的光学弹性成像技术，为生物力学研究带来了新的契机。当布里渊显微镜与共聚焦显微镜结合后，具备了三维衍射极限分辨率，在生物研究领域展现出广泛的应用前景，涵盖了从活细胞内生物力学研究到疾病诊断等多个方面。

传统技术的困境
尽管布里渊显微镜前景光明，但传统的自发布里渊散射面临着信号微弱的难题。为了克服这一障碍，受激布里渊散射（SBS）技术应运而生，实现了高光谱分辨率和高机械特异性，同时缩短了生物样本的采集时间。然而，目前的SBS技术也并非完美无缺。通常要求样本相对透明、厚度小于100-200μm，并且需要从两侧进行光学访问，这限制了其适用范围。此外，现有的SBS需要较高的泵浦功率。高功率照明不仅会导致样本加热，产生光毒性，影响样本的生理状态，还限制了对光敏样本的长时间成像，使得其在生命科学领域的广泛应用受到阻碍。因此，开发一种能够克服这些局限性的新技术，成为了生物力学研究领域的迫切需求。

技术创新与应用
脉冲SBS技术原理剖析
为了解决传统SBS技术的不足，研究团队提出了脉冲泵浦-探测方法。从原理上看，在连续波泵浦和探测方案中，SBS信号与泵浦和探测光的平均功率乘积以及相互作用时间成正比；而脉冲方案则有所不同，其信号与脉冲峰值功率的平方以及脉冲宽度成正比。在平均功率相同的情况下，脉冲方案的有效增强因子E与占空比成反比。这意味着在相同激光功率下，脉冲方案能够获得更高的信噪比（SNR）。利用这一优势，在保持相同信噪比和探测功率的同时，可以大幅降低泵浦功率，从而减少对样本的光损伤，为对光敏生物样本的成像提供了可能。

实验装置与优化细节
研究团队精心搭建了一套脉冲SBS显微镜系统。泵浦和探测激光在进入样本前，分别要经过一系列复杂的光学处理过程。为了使系统性能达到最佳，研究人员对多个关键参数进行了仔细优化，经过这些优化，该系统在低照明剂量下，也能实现与传统连续波SBS相当的信噪比、光谱分辨率、图像质量和成像速度，为后续的实验研究奠定了坚实基础。

技术优势与潜在应用领域
脉冲SBS技术展现出了诸多显著优势。首先，在降低照明功率方面成效显著，与传统连续波SBS相比，能实现超过10倍的功率降低，极大地减少了光毒性，使得对各种光敏生物样本进行长时间成像成为现实。其次，该技术具备较高的空间分辨率和光谱分辨率，能够精准区分样本中不同的力学成分，为深入研究生物样本的微观力学特性提供了有力手段。

在细胞生物学中，可以帮助研究人员深入探究细胞内不同细胞器的力学性质，以及这些性质在细胞生理和病理过程中的变化；在发育生物学方面，能够实时监测胚胎发育过程中组织和器官的力学动态变化，助力揭示胚胎发育的奥秘；在疾病研究领域，有助于发现疾病发生发展过程中组织力学性质的改变，为疾病的早期诊断和治疗提供新的生物标志物和潜在靶点。

成像实验与结果分析
小鼠细胞成像
研究团队率先对小鼠细胞进行了布里渊成像实验，将脉冲SBS成像结果与准连续波照明下的图像进行对比。结果令人惊喜，脉冲SBS获取的布里渊频移图呈现出高图像质量和良好的信噪比。借助这一技术，研究人员能够清晰分辨出核仁等具有细微力学差异的亚细胞结构。通过对光谱数据的深入分析，还可以绘制出布里渊频移、增益和线宽的空间图，进一步展示了该技术的高成像质量和信噪比。

为了评估脉冲SBS对细胞活力的影响，研究人员用碘化丙啶（PI）对细胞进行染色检测。结果显示，脉冲SBS成像15小时后，细胞未出现膜和染色体损伤。而连续波SBS成像虽然能获得类似的对比度和质量，但却出现了明显的光损伤迹象。同时，细胞不同区域（核仁、核质和细胞质）的布里渊频移整体升高，这表明样本可能因光照而发热。这些实验充分表明，在基于SBS的单细胞成像中，将总照明水平控制在低功率对于确保细胞活力至关重要，而脉冲SBS技术在这方面具有明显优势。

活体斑马鱼和秀丽隐杆线虫成像
研究团队对受精后3天的活体斑马鱼幼体尾部进行了低功率脉冲SBS成像。斑马鱼幼体尾部围绕脊索的区域包含一层超薄且机械刚性高的细胞外基质（ECM），对组织结构起着关键的支撑作用。脉冲SBS图像清晰地呈现出了包括ECM、脊索和周围肌肉节段（包括脊髓区域）在内的多种组织类型。了更好地分析多峰布里渊光谱，研究团队开发了定制的分析方法和GPU增强拟合管道。借助这些工具，他们在分析ECM区域时，发现了布里渊频移的三峰分布，分别对应ECM周围组织成分以及ECM的两种声学模式。此外，在脊髓中央管区域，研究人员观察到双峰布里渊光谱，分别对应脑脊液和可能的搏动纤毛。这一结果表明，脉冲SBS能够在衍射极限焦体积内和活体内精准识别不同的生物力学成分，为研究活体组织的力学特性提供了有力支持。

还对年轻成年期的野生型秀丽隐杆线虫进行了成像研究。结果显示，在照明功率降低10倍的情况下，仍能获得相似的信噪比和整体对比度。在对秀丽隐杆线虫性腺区域的高分辨率成像中，发现减数分裂核的布里渊频移在卵母细胞成熟过程中降低。早期卵母细胞核中，较低布里渊频移的核质围绕着较高布里渊频移的核仁，而在晚期卵母细胞中，核质和核仁区域的布里渊频移均降低。这种布里渊频移的变化与染色质从早期到晚期卵母细胞的压实增加密切相关。此外，对活体小鼠胚胎的成像实验表明，脉冲SBS能够获得高质量的图像和亚细胞细节，而连续波SBS的高功率会捕获胚胎，导致无法进行成像。这些结果进一步证明了脉冲SBS技术在活体生物成像方面的优势和潜力。

小鼠乳腺类器官成像
研究团队对小鼠乳腺上皮类器官进行了成像研究。在类器官发育的不同阶段（接种单细胞后48小时、70小时和80小时）进行成像后发现，上皮组织和细胞在横向和轴向横截面中都能清晰分辨。通过量化布里渊线宽，研究人员观察到类器官管腔在发育早期（48小时）到晚期（70小时和80小时）线宽出现了约200MHz的短暂降低。这一现象与类器官管腔形成过程中的多种生物学过程有关，包括细胞分裂、膜泡内吞以及离子通道和泵在顶膜积累导致的静水压力变化等。在80小时的成熟类器官中，轴向横截面图像显示侧上皮的布里渊频移比上皮的上、下帽高100MHz。总体而言，脉冲SBS成像后类器官仍保持活力，表明该技术在研究类器官发育和功能方面具有重要的应用价值。

秀丽隐杆线虫胚胎成像
作为脉冲SBS技术低光毒性和可视化动态组织特性能力的最终展示，研究团队对受精后约300分钟至480分钟的秀丽隐杆线虫胚胎进行了纵向和二维力学信息成像。在这个胚胎发育的关键时期，组织形态发生开始，大多数细胞分裂已经完成。研究团队在视野内，以13分钟的时间间隔获取二维布里渊时间序列图像。通过分析这些时间序列数据，发现胚胎不同部位和发育阶段的布里渊频移存在明显差异。在胚胎形态发生过程中，较高的布里渊频移标记了胚胎的后部，主要由将形成肠道的内胚层细胞组成。在平均激光功率约27mW的情况下，未观察到光损伤或光毒性，所有成像的胚胎都经历了抽搐和正常发育，最终孵化成有活力的幼虫。这与标准连续波SBS（约265mW）形成鲜明对比，连续波SBS在获取少数二维图像后就会导致胚胎损伤和死亡。这充分表明脉冲SBS技术在研究胚胎发育过程中的力学变化方面具有显著优势，为深入理解胚胎发育的力学机制提供了新的有力工具。

总结与展望
脉冲激发布里渊显微镜的突破，首次实现了对光敏感样本的长时程、高分辨观测，其27mW的安全功率阈值（相当于手机闪光灯1%的强度）彻底改变了活体成像的游戏规则。在斑马鱼脊索中发现的三重声学模式、线虫胚胎发育的力学时序图谱、以及乳腺类器官管腔形成的粘弹性演变，这些突破性成果预示着生物力学研究正从静态描述迈向动态机制解析。未来，与光学衍射层析技术的结合，将实现复杂模量的绝对定量，建立从分子聚集到组织弹性的完整力学模型。临床转化方面，该技术已展现出透过小鼠颅骨检测脑组织病变的潜力，或将成为阿尔茨海默病早期诊断的新利器。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Yang F, Bevilacqua C, Hambura S, Neves A, Gopalan A, Watanabe K, Govendir M, Bernabeu M, Ellenberg J, Diz-Muñoz A, Köhler S, Rapti G, Jechlinger M, Prevedel R. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 2023 Dec;20(12):1971-1979. doi: 10.1038/s41592-023-02054-z. Epub 2023 Oct 26. Erratum in: Nat Methods. 2024 May;21(5):922.

DOI:10.1038/s41592-024-02259-w.