Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis

Keywords: TNF‐α; articular cartilage breakdown; chondrogenic 3D model; immune cells; matrix degeneration; mesenchymal stromal cell; microfluidic system; pro‐inflammatory cytokine.

进行性软骨退化和软骨下骨破坏是两种主要关节疾病的标志：骨关节炎（OA）和类风湿性关节炎（RA）。关节软骨是一种富含细胞外基质（ECM）的组织，由 60%–80% 的水、20% 的蛋白聚糖/聚集蛋白聚糖、5% 的 II 型胶原蛋白（Col）和 1%–5% 的软骨细胞组成。

压缩应力和剪切应力是主要的机械应力，如果它们过大会导致软骨和关节功能障碍、损伤和疼痛。生理水平的压缩和流体剪切应力通过促进软骨细胞增殖、ECM 产生、生长和分化对关节软骨产生积极影响。然而，这种机械应力也会产生负面影响，例如当过度压缩应变时会导致软骨细胞死亡和促炎因子的分泌。此外，由于必要的机械应力供应不足，低生理应力会导致软骨细胞凋亡和基质降解。

传统的体内模型难以分离和研究机械应力对软骨健康的具体影响。目前，在临床前研究中，在体外 3D 人类软骨微结构（CMCs）上模拟关节运动过程中机械应力的微生理系统（MPSs）变得越来越重要。这些 3D CMCs 整合了细胞、可溶性因子和 ECM 样基质，提供了细胞间相互作用和对基质产生和降解的见解，以模拟关节软骨。

因此，德国柏林夏里特医院风湿病学和临床免疫学系、瑞士西北应用科学与艺术大学生命科学学院的团队联合开发了一种可施加剪切应力的 MPS，从而产生类似于在体内关节运动期间观察到的生物反应。该研究证明了生理剪切应力保护 CMC 免受 TNF-α介导的关节炎的影响；另一方面，病理学上的低机械应力使基质沉积和再吸收的平衡在 TNF 处理后转向分解代谢，这种效果可以通过 JAK 抑制来恢复。研究成果发表于 Advanced Science 期刊题为“Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis”。

首先，使用低生理（0 Pa）与生理（0.2 Pa）力在 MPS 中将 CMC 暴露于流体剪切应力，检测分析细胞活力和细胞凋亡，发现其对细胞活力和死亡没有影响，但细胞凋亡显著减少（图1 a-d）。然后，分析了 ECM 标志物 ACAN、COL2A1、COL1A1、COMP 和基质降解酶MMP1、MMP3 和 MMP13 的基因表达，观察到 ACAN、COL2A1 的表达较高，COL2A1 与 COL1A1 的比率较高，但在 0.2 Pa 的流体剪切力下（对应于生理力条件）下，COL1A1、COMP 和 MMP13 的表达较低，这表明软骨形成增强，ECM 形成以及 ECM 降解减少（图1 e）。

在蛋白质水平上，CMCs 表现出更高的软骨特异性 ECM 沉积物，例如 II 型胶原蛋白（COL2）和聚集蛋白聚糖（ACAN），而 I 型胶原蛋白（COL1）和基质降解酶（MMP1 和 MMP13）在 0.2 Pa 的流体剪切应力下表达较少（图1 f）。值得注意的是，促纤维化收缩肌动蛋白亚型α 平滑肌肌动蛋白（αSMA）在 0.2 Pa 时表达较低。有趣的是，实验观察到 CMCs 的内、中、外段对机械应力的不同响应。具体来说，在生理剪切应力下，合成代谢软骨形成 ECM 成分，如 COL2 和 ACAN，在比较的外部部分主要表达较高。相反，与外部相比，COL1 在内部部分的表达更高。在生理剪切应力下，分解代谢 MMP1 和 MMP13 表达量保持不变，而在 0 Pa 的流体剪切应力下表达较高。值得注意的是，促纤维化 αSMA 仅在 0 Pa 时表达较高。

这些结果表明，在长期生理剪切应力条件下培养 CMCs 会触发合成代谢基因的表达，促进软骨发育，并对 CMC 的内、中、外区域的软骨细胞凋亡和基质降解产生差异影响。

图1 14 天的生理流体剪切应力可保护 CMC 免受细胞凋亡和基质降解，从而形成成熟的 3D CMC。

一个基本的临床经验是，适度、针对性和定期的运动疗法对于大多数风湿性疾病（包括 OA 和 RA）至关重要。因此，研究人员假设，如果体外模型可以反映关节炎的变化并模拟关节内的机械影响，那么模拟关节运动的生理剪切力条件应该可以保护实验建立的成熟 CMCs 免受 TNF-α介导的损伤。

为此，用 TNF-α（100 ng ml）刺激 CMC 6 小时，发现 TNF-α 刺激显著降低了 Calcein-AM+ 细胞的相对数量（作为细胞存活的衡量指标），但在 0.2 Pa 模拟关节运动时降低程度较低。此外，与未处理的 0.2 Pa 组相比，0.2 Pa 的 TNF-α 处理导致 BCL2-BAX 比率降低，但仍高于 0 Pa 组。WST-1 水平在 TNF-α 处理后在 0 Pa 时比在 0.2 Pa 时增加的程度更高，表现出更高的代谢活性，而 0.2 Pa 的 TNF-α 处理减少了氧摄取和乳酸产生，表明葡萄糖摄取降低。然后，分析了 TNF-α介导的 IL-6 分泌作为 CMC 炎症反应的指标，发现随着时间的推移，在 0 Pa 条件下 TNF-α 的降低伴随着 IL-6 分泌的增加，而在 0.2 Pa 条件下观察到可溶性促炎细胞因子 IL-6 的水平显著降低。这些数据表明，生理性剪切力减少TNF-α刺激的CMC细胞凋亡和IL-6分泌。

众所周知，TNF-α 通过诱导 MMPs 的表达导致聚集蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白的降解。因此，接下来研究了 0 和 0.2 Pa 剪切应力对 TNF-α介导的炎性 IL6、TNFA 和 IL8、促纤维化 TGFB 和参与 ECM 周转的分子 ACAN、COL2A1、COL1A1、COMP、MMP1、MMP3 和 MMP13 基因表达的影响（图2 a）。虽然 IL6、TNFA 和 IL8 不受不同剪切应力的影响，但与低生理力相比，0.2 Pa 的生理剪切应力降低了促纤维化 TGFB 和 COMP。值得注意的是，0.2 Pa 的生理条件下 ACAN、COL2A1 的表达显著升高，COL1A1 表达降低，从而增加 COL2A1 与 COL1A1 的比率。TNF-α刺激后 MMP1 和 MMP13 在 0 Pa 时的表达显著升高（图2 a）。

利用免疫荧光分析确定负责维持 0.2 Pa 下 CMC 生理机能的区域，发现CMCs 的内部区域对剪切应力引起的 ECM、COL2 和 ACAN 的合成代谢分子的变化敏感。外部区域对 ECM 的分解代谢分子，即 MMP1 和 MMP13 敏感（图2 b、c）。值得注意的是，ACAN 似乎也受到了外部区域的影响。

这些结果表明，0.2 Pa 的生理剪切应力可能在维持 MPS 中的 CMC 稳态方面具有保护作用，而 0 Pa 的低生理剪切应力则支持 CMC 损伤。

图2 生理剪切应力可防止 TNF 介导的 CMC 损伤，维持 CMC 稳态，而低生理剪切应力支持 TNF 介导的 CMC 损伤。

最后，添加 JAK 抑制剂（JAKi）巴瑞替尼（baricitinib）处理 PBMCs 和 CMCs（图3 a）。确认了添加活化的 PBMCs 或它们与巴瑞替尼的组合不会影响 CMCs 的活力、细胞毒性或细胞凋亡（图3 b、c）。其次，发现 PBMC-介导的 caspase 3/7 活性的显著诱导（图3 c）和 BCL2 与 BAX 比率的降低（图3 d），这被巴瑞替尼处理逆转。添加活化的 PBMCs 导致软骨细胞和免疫细胞的代谢率改变。虽然培养基的氧饱和度最初降低，但与未处理的 CMCs 相比，两天后氧饱和度增加。添加巴瑞替尼恢复了培养基的氧饱和度（图3 e）。值得注意的是，培养基氧饱和度的降低表明细胞耗氧量增加。用活化的 PBMCs 处理的 CMCs 中培养基中葡萄糖的含量比单独的 CMCs 减少得少，但比用活化的 PBMCs 和添加巴瑞替尼处理的 CMCs 减少得更多（图3 f）。当用活化的 PBMCs 处理 CMCs 时，乳酸量随着时间的推移而增加。相反，添加巴瑞替尼导致乳酸水平与在未处理的 CMCs 中观察到的乳酸水平相似（图3 f）。

在基因表达水平上，免疫细胞介导的 CMCs 激活显著增加了 IL6 和 IL1B 以及基质降解酶的表达，这导致 RA 的关键现象——软骨降解（图3 g）。这些影响也可以通过 JAK 抑制来减弱。在形态学上，含有细长细胞的外部区域在使用活化的 PBMCs 刺激后消失，从而显示出浅表细胞层浸渍的迹象（图3 h）。此外，免疫细胞诱导导致软骨 ECM 分解的 MMP1 和 MMP13 表达增加，并被巴瑞替尼消除（图3 h）。

关节炎 CMC 的药理学验证了，活化的 PBMCs 降低 ACAN 和 COL2A1 表达并促进 MMP1 和 MMP13表达，而 JAK 抑制剂巴瑞替尼则相反。

图3 激活的 PBMCs 诱导体液介导的 CMC 损伤、炎症介质和 MMP，这些损伤被随后的 JAK 抑制减弱。

该研究揭示了关节炎样表型的发展，并在生理剪切应力下，通过 JAK 抑制剂成功恢复了软骨状况。生理剪切应力被认为是维持软骨完整性的关键因素。该 MPS 提供了一种标准化方法来研究剪切应力、复制细胞因子诱导的软骨损伤和模拟关节炎的关键特征，为动物模型提供了有价值的替代方案。

参考文献：Damerau A, Nguyen DHD, Lubahn C, Renggli K, Pfeiffenberger M, Krönke G, Herrmann M, Leeuw T, Buttgereit F, Gaber T. Microphysiological System-Generated Physiological Shear Forces Reduce TNF-α-Mediated Cartilage Damage in a 3D Model of Arthritis. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 24:e2412010. doi: 10.1002/advs.202412010. Epub ahead of print. PMID: 39716911.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39716911/

Online ISSN:2198-3844

Print ISSN:2198-3844

2023 Journal Impact Factor (Clarivate):14.3

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