The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis

Keywords: Bone biology; Bone disease; Osteoporosis; Therapeutics.

糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP）是在接受糖皮质激素治疗的自身免疫性疾病患者中观察到的主要副作用。GIOP 患者的骨折风险与骨密度（BMD）的相关性低于传统骨质疏松症患者，这表明糖皮质激素对骨质量和骨量有负面影响。重要的是，机械应力锻炼已被证明可以增强 GIOP 中的 BMD。虽然单独使用阿仑膦酸钠是不够的，但它与机械应力的结合会显著提高 BMD。这些发现表明，模拟骨细胞机械应力的治疗可能是 GIOP 药物开发的突破。

目前，使用条件性骨细胞特异性 Piezo1 敲除小鼠的研究表明，Piezo1 的缺失会导致皮质骨参数受损，这突出了 Piezo1 在通过钙内流和上调 Wnt 通路介导机械诱导骨形成中的重要性。Yoda1 是一种 Piezo1 激动剂，已被证明可以增加完整啮齿动物的 BMD 并缩短小鼠骨折的愈合时间。然而，Piezo1 激活对疾病进展期间 GIOP 小鼠模型中机械应力的影响尚未见报道。

最近，大阪大学医学研究院肌肉骨骼再生医学系、骨科生物材料科学系及运动医学生物力学系课题组的一项研究旨在阐明机械敏感受体 Piezo1 在 GIOP 发病机制中的作用和机制，并探讨了 Piezo1 通路的激活是否可以改善 GIOP 的状况。研究结果表明，骨细胞和骨膜细胞中 Piezo1 表达和活性的降低有助于 GIOP，而Yoda1 可能通过恢复机械敏感性提供来一种新的治疗方法。研究成果发表于 JCI Insight 期刊题为“The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis”。

首先，实验研究了 GIOP 和非 GIOP 骨组织之间的病理生理差异，发现与非 GIOP 患者相比，GIOP 患者组织中空腔隙的比例明显更高。值得注意的是，GIOP患者骨细胞中Piezo1表达下调，且在 GIOP 组中观察到 TUNEL 阳性骨细胞的显著增加。

然后，在 GIOP 模型中研究了 Yoda1 的作用。对小鼠同时给予地塞米松（DEX）和 Yoda1 处理，发现与对照处理组相比，DEX 处理组的骨体积分数（BV/TV）、小梁数（Tb. N.）和皮质厚度（Ct. Th.）显著降低，但用 DEX 和 Yoda1 联合治疗后，这些影响几乎完全缓解。此外，皮质骨孔隙率（Po. tot 和 Po.V）和与骨小梁结构相关的参数在 DEX 组中显著加剧，但因 Yoda1 而减弱。骨组织形态学分析显示，DEX 组成骨细胞表面（Ob. S/OS）、类骨质体积（OV/OS）、皮质骨宽度（Ct. Wi.）和皮质骨面积（Ct. Ar.）显著降低，但Yoda1 有效防止了这些影响。在进一步研究潜在机制时，分析显示在 DEX 处理组，骨细胞中的 Piezo1 表达显著降低。这些数据表明，Yoda1 可防止 GIOP 小鼠模型股骨的结构变化和脆弱性。

在体内，对小鼠进行轴向胫骨负荷（13N）以直接评估在 GIOP 背景下受损的机械应力响应（图1 A）。然而，与对照处理组相比，DEX 处理组对机械负荷没有反应。相比之下，同时接受 DEX 和 Yoda1 给药的组在负荷干预后表现出 BV/TV、Tb. N 和 Ct. Th. 的显著增强，类似于对照处理组（图1 B、C）。此外，机械负荷显著降低了对照组和 DEX 和 Yoda1 联合处理组 Po. tot 水平，增加了矿物质附着率（MAR）、骨形成率（BFR）、骨钙素-阳性骨膜细胞水平，而 DEX 处理组未发现这种负荷响应（图1 C-H）。相比之下，无论机械负荷如何，DEX 处理组骨小梁表面的 TRAP 阳性细胞数量都显著增加，而在对照或 DEX 和 Yoda1 联合处理组中未观察到这一点（图1 I、J）。这些数据表明，Yoda1 减弱了糖皮质激素引起的机械应力的衰减反应。

图1 Yoda1 逆转糖皮质激素诱导的机械驱动骨反应的衰减。

在检查了一系列表明骨细胞有显著影响的体内数据后，接下来进行了人皮质骨器官培养测定，以阐明基因表达对骨代谢关键作用的影响（图2 A-D）。结果发现，PIEZO1 和 PTGS2 表达水平被 DEX 处理抑制，而 Yoda1 保留了与对照相当的基因表达水平（图2 A ）。相反，DEX 处理后 SOST 和 RANKL/OPG 比率上调，但在 Yoda1 处理后保持在对照水平（图2 B、D）。此外，在DEX 和 Yoda1 处理下，WNT16 表达增加（图2 C）。在蛋白质水平上，MLO-Y4 细胞系中的 Piezo1 表达被 DEX 降低，但 Yoda1 处理可使其得到剂量反应性恢复（图2 E）。此外，研究了 Piezo1 中的下游磷酸化信号通路，发现 Yoda1 处理上调了 Akt 和 ERK 磷酸化，而这被 DEX 处理下调，且Yoda1 可以促进被 DEX 抑制的 Akt 和 ERK 磷酸化（图2 F、G）。

定量评估 MLO-Y4 细胞中的钙内流，发现 Yoda1 可显著加速 Ca2+ 内流，但与 3 μM DEX 预孵育减弱了这种影响。相比之下，与 1 μM DEX 和更高浓度的 Yoda1（10 μM）共处理可将 Ca2+ 内流恢复到对照水平（图2 H、I）。进一步研究以探索 Ca2+ 对钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化的下游影响，表明 Yoda1 增强了 CaMKII 磷酸化。有趣的是，选择性抑制剂 KN-93 对 CaMKII 的抑制导致 Akt 磷酸化的剂量依赖性降低（图2 J）。骨细胞的形态学分析显示，DEX 处理后肌动蛋白交联点增加，但这种增加通过同时使用 DEX 和 Yoda1 而剂量依赖性地减弱（图2 K、L）。这些数据表明，Yoda1 通过钙调蛋白激酶II-依赖性 Ca2+ 内流介导对 DEX 诱导的基因表达、骨细胞形态和 Akt 磷酸化变化的抵抗。

图2 DEX 和 Yoda1 对人皮质骨和 MLO-Y4 细胞的影响。

为了研究糖皮质激素介导的机械应力反应的机制，进行了 RNA-seq 分析，比较了对照处理组和 DEX 处理组在 5 天内的小鼠胫骨轴向负荷反应。在负荷期间，对照组和 DEX 处理组之间的比较基因表达分析显示，Piezo1 和 Tnfrsf11b（OPG）表达显著降低，而 DEX 处理组的 Tnfrsf11a（RANK）表达增加。进一步缩小对机械刺激反应的骨细胞特异性基因的关注范围，分析显示 Hes1 是 LIPUS 处理后唯一显示上调的基因。

然后，研究了 Hes1 是否充当 Piezo1 的转录因子（图3）。在 MLO-Y4 细胞中敲低 Hes1 后，发现 Piezo1 表达在 mRNA 和蛋白质水平上均降低（图3 A 、B）。进一步确认 Hes1 与 Piezo1 基因的结合，发现用 Yoda1 处理显著增强了 MLO-Y4 细胞中 Hes1 结合区的扩增，而 DEX 处理和 Hes1 敲低则没有（图3 C、D）。此外，Piezo1 转录活性被 DEX 处理抑制，并被 Yoda1 显著挽救（图3 E）。同时，还研究了 DEX 和 Yoda1 处理在基因和蛋白质水平上对 Hes1 表达的影响（图3 F-H），发现 DEX 处理诱导 Hes1 mRNA 水平呈剂量依赖性降低，而 Yoda1 处理增加 Hes1 mRNA 水平（图3 F、G）。值得注意的是，发现 Hes1 磷酸化在 DEX 处理下降低，而在 Yoda1 处理下增加（图3 H）。这些数据表明，Hes1 作为 DEX 和 Yoda1 调节 Piezo1 的调节转录因子。

图3 Hes1 是由 DEX 和 Yoda1 调控的 Piezo1 的调节转录因子。

小鼠模型（胫骨）和股骨颈 GIOP 患者的皮质骨（包括骨膜）的翻译分析揭示了与成骨细胞和软骨细胞功能相关的 10 个基因的列表。这一发现表明，在 GIOP 中，成骨前细胞向成骨细胞的分化受到抑制。为了进一步研究这一点，比较了从全膝关节置换术和 MC3T3-E1 细胞获得的人 PDCs 中成骨细胞分化过程中的 Piezo1 表达（图4 A ）。人 PDCs 在成骨细胞分化的早期显示 Piezo1 表达上调，这被 DEX 处理抑制。然而，与 DEX 和 Yoda1 的共处理可显著诱导 Piezo1 表达（图4 A）。相反，MC3T3-E1 细胞在 Piezo1 表达方面没有表现出任何显著变化。

最后，以 PDCs 为重点，对 10 个基因进行定量 PCR 分析，发现 6 个基因 （ACAN、SOX9、SFRP1、SFRP2、SMOC1、COL14A1）在 DEX 处理后显著下调，但Yoda1 处理显著逆转了这种效果（图 4 B）。进一步评估 DEX 和 Yoda1 处理对 PDCs 成骨细胞分化的影响（图4 C-F），发现DEX 显著降低了 ALP 活性，但当 DEX 和 Yoda1 同时使用时，这种影响得到了缓解（图4 D）。同样，当 DEX 和 Yoda1 联合时，通过 DEX 处理显著降低的茜素红S 染色显示出较弱的抑制（图4 F）。这些数据表明，DEX 和 Yoda1 影响人 PDCs 中 Piezo1 的表达和成骨细胞分化。

图4 DEX 和 Yoda1 对 PDCs 中 Piezo1 表达和成骨细胞分化的影响。

图5 Yoda1 通过 Hes1/Piezo1 信号诱导骨细胞功能增强。

Yoda1 通过激活 Hes1 增强 Piezo1 表达，增加骨细胞中的 CaMKII 和 Akt 磷酸化。这导致腔隙-小管网络（LCN）得到改善，硬化蛋白产生减少，RANKL/OPG 比率平衡，这些影响被 DEX 减弱。

总之，该研究揭示了 GIOP 患者皮质骨组织中 LCN 和 Piezo1 的表达下调。此外，GIOP 小鼠模型显示对机械应力的反应减弱，突出了 Piezo1 在疾病进展中的关键作用。Yoda1 是一种 Piezo1 激活剂，其给药抵消了 GIOP 模型中受损的机械应力反应。这项研究不仅提供了对 GIOP 病理生理学的见解，还通过靶向 Piezo1 激活和模拟机械应力为该疾病提供了潜在的治疗策略。

参考文献：Ochiai N, Etani Y, Noguchi T, Miura T, Kurihara T, Fukuda Y, Hamada H, Uemura K, Takashima K, Tamaki M, Ishibashi T, Ito S, Yamakawa S, Kanamoto T, Okada S, Nakata K, Ebina K. The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis. JCI Insight. 2024 Dec 6;9(23):e179963. doi: 10.1172/jci.insight.179963. PMID: 39641269; PMCID: PMC11623955.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39641269/

2023 Impact Factor: 6.3

ISSN: 2379-3708

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